细胞穿透型HO-1蛋白对协调性异种心脏移植急性排斥反应的作用

郑祥韬 戴驹骥 徐东宇 裘益辉 杨法镜 虞冠锋

细胞穿透型HO-1蛋白对协调性异种心脏移植急性排斥反应的作用

郑祥韬 戴驹骥 徐东宇 裘益辉 杨法镜 虞冠锋

目的 探讨一种新型的细胞穿膜肽（PTD）整合的血红素氧合酶-1（HO-1）蛋白对协调性异种心脏移植急性排斥的作用及初步机制。方法 将C57BL/6小鼠心脏移植至Wistar大鼠颈部，建立协调性异种心脏移植模型，将其随机分成单纯移植组（control）、PTD整合荧光蛋白对照组（移植术后腹腔注射PTD-GFP 10mg/d）和PTD-HO-1蛋白治疗组（移植术后腹腔注射PTD-HO-1 1mg/d），观察移植心脏存活时间。取移植后48h小鼠心脏，HE染色观察心脏组织结构，免疫组化染色观察CD4和CD8阳性T细胞浸润情况，蛋白印记杂交法测定心脏移植物HO-1蛋白的表达。取移植后48 h大鼠血清，ELISA试剂盒检测血清免疫复合物IgM水平及细胞炎症因子IL-2和IFN-γ水平。结果 PTD-HO-1组移植心脏存活时间（6.17±1.17）d明显高于单纯移植组（2.67±0.52）d和PTD-GFP组（2.83±0.41）d，差异有统计学意义（P＜0.01）。移植术后48 h，PTD-HO-1组移植心脏组织结果破坏程度较其他两组轻，CD4和CD8阳性T细胞浸润情况较其他两组明显减轻，差异均有统计学意义（P＜0.01）。PTD-HO-1组受体血清IgM、IL-2和IFN-γ水平明显低于其他两组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。而心脏移植物组织内HO-1表达水平明显高于其他两组，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。结论 PTD整合的HO-1蛋白能延长协调性异种移植心脏的存活，为HO-1在异种移植的临床应用提供了可能。

细胞穿膜肽 血红素氧合酶-1 协调性异种心脏移植 急性排斥

作为治疗终末期心脏衰竭患者的唯一有效手段，心脏移植在全世界得到了普遍的发展［1］。但供体器官来源的缺乏促使越来越多的学者开始尝试异种移植的研究，来进一步扩大器官供池。在协调性异种移植中，移植术后数天内发生的急性血管排斥反应（acute vascular rejection，AVR）是导致移植失败的主要原因之一［2］。因此，如何延缓或减轻AVR的发生成为协调性异种移植的关键。在先前的研究中合成了一种新型的细胞穿透型血红素氧合酶-1蛋白（protein transduction domain heme oxygenase-1，PTD-HO-1），大量的前期数据证明该新型蛋白具备强大的穿透能力和细胞保护功能［3］。在本实验中，作者将该HO-1蛋白用于对抗协调性异种心脏移植的排斥反应，并探讨其保护作用的可能机制，为下一步临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及试剂 （1）实验动物：雄性C57BL/6小鼠18只，体重20～25 g，作为供者；Wistar大鼠，体重250～300 g，作为受者，均由温州医科大学实验动物中心提供。（2）试剂：PTD-HO-1蛋白和对照用荧光蛋白（PTD-GFP）由先前研究中生产，保存温度-80℃。HO-1抗体、CD4和CD8抗体购自美国Sigma公司。ELISA试剂盒购自美国Alpco公司。

1.2 实验分组与心脏移植 （1）分组：将Wistar大鼠随机分成A、B、C 3组，每组各6只。A组为空白对照组（control组），受者仅做单纯移植处理；B组为无关蛋白对照组（PTD-GFP组），受者于移植当天起腹腔内注射PTD-GFP蛋白10mg/d；C组为治疗组（PTDHO-1组），受者于移植当天起腹腔内注射PTD-HO-1蛋白10 mg/d。（2）心脏移植：遵循温州医科大学实验动物福利和伦理的原则，采用二袖套法，将小鼠升主动脉和肺动脉分别与大鼠的右颈总动脉和右颈外静脉吻合［4］。移植后每天触摸移植心脏跳动情况，以心跳停止作为排斥反应的终点。术后48h收割部分心脏移植物，保存于液氮中。

1.3 病理及血清学指标检测 （1）组织病理学：取移植术后48h心脏移植物冰冻切片直接在荧光显微镜下观察，同时行HE染色观察组织病理改变。采用免疫组化ABC法检测细胞和组织中的CD4+和CD8+T细胞的浸润，各切片随机观察10个高倍视野（×400），记录阳性细胞数，取平均值。（2）血清学指标：移植术后48h大鼠尾静脉取血，制备血清，采用ELISA试剂盒对IgM、IL-2、IFN-γ含量进行检测，操作步骤严格按照说明书进行。（3）HO-1蛋白测定：采用蛋白印记杂交法（WB）测定术后48 h心脏移植物HO-1蛋白的表达。以Sigma公司细胞组织快速裂解液裂解心脏移植物，Bradford法检测蛋白浓度，经SDS-PAGE电泳后，转膜，依次孵育HO-1一抗及相应二抗，以WB发光试剂检测HO-1表达量，以蛋白区带积分吸光度值表示。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件。计量资料以（±s）表示。各组移植心脏生存时间用Kaplan-Meier方法分析，血清细胞因子、IgM抗体水平、CD4+和CD8+T细胞计数采用方差分析，计量资料组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组移植心脏的存活时间 Control组（2.67±0.52）d和PTD-GFP组（2.83±0.41）d 之间移植心脏的存活时间无明显差异（P＞0.05），而PTDHO-1蛋白组（6.17±1.17）d移植心脏的存活时间明显长于其他两组，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 移植心脏病理学改变 PTD-HO-1蛋白组移植心脏内心肌结构基本正常，心肌细胞轻度肿胀。而其他两组心肌细胞严重肿胀变性，部分组织出现溶解坏死，广泛间质出血，血管结构崩解（图1A，HE染色）。同样，术后48h，PTD-HO-1组移植心脏炎症浸润情况较其他两组明显减轻，CD4和CD8阳性细胞数明显减少，差异有统计学意义（n=3/组，P＜0.01，图1 A～C）。通过荧光显微镜对PTD-GFP组心脏移植物冰冻切片进行观察，未发现明显绿色荧光，结果显示PTD整合的荧光蛋白并未穿透进入心脏组织。

图1 移植心脏术后48h病理学改变（A：HE染色，CD4和CD8免疫组化，×200。B和C：CD4和CD8阳性细胞计数，各切片随机观察10个高倍视野（×400）。与contro1组比较，★P＜0.01；与PTD-GFP组比较，#P＜0.01）

2.3 移植术后受体血清学指标 心脏移植术后48h， PTD-HO-1治疗组血清IL-2和IFN-γ以及抗体IgM水平明显低于其他两组（n=3/组，P＜0.05），而其他两组之间无明显差异（图2）。

图2 心脏移植术后48h受体血清炎症因子及抗体表达水平（A：ELISA检测血清IL-2水平。B：ELISA检测血清IFN-γ水平。C：ELISA检测抗体IgM水平。与contro1组比较，★P＜0.05；与PTD-GFP组比较，#P＜0.05）

2.4 移植心脏内HO-1蛋白表达情况 通过WB检测术后48h心脏移植物内HO-1的表达水平，结果显示PTD-HO-1组的HO-1表达明显高于其他两组（n=3/

图3 移植心脏术后48h HO-1蛋白表达水平。（A：HO-1表达量以蛋白区带积分吸光度值。B：蛋白印迹图。与contro1组比较，★P＜0.01；与PTD-GFP组比较，#P＜0.01）

3 讨论

在心脏移植中，供体的严重不足极大的限制了其发展。随着对排斥反应机理的深入研究，人们对异种移植（xenotransplantation）的兴趣和研究快速升温［5］。异种移植需要面临移植后快速出现的两大免疫学障碍：超急性排斥反应（hyperacute rejection，HAR）和AVR［6］。目前，HAR的发生机制已基本研究清楚，近年大量研究工作显示该免疫学障碍有望得到突破性发展［7］。于是AVR逐渐成为异种移植面临的主要障碍，其特点是开始于移植后再灌注的24h内，并在数天破坏移植物，而且传统免疫抑制剂效果不理想［8］。因此，成功跨越AVR屏障对于异种移植研究具有重要意义。

HO-1是人体内一种重要的应激酶，研究证明诱导动物体内HO-1的过表达能起到抗排斥的作用［9］，在已有的异种移植中，HO-1能明显延长移植物的生存时间［10］，但其临床应用却存在极大的限制。因为尚无一种试剂能特异性诱导HO-1的表达，而在利用HO-1的代谢产物CO或胆绿素时，由于其毒性将其应用限制在一个狭小的治疗窗内。另外由于HO-1基因治疗的不可控性，目前相关研究仍局限在动物实验中。本资料中，作者利用该蛋白对抗协调性异种心脏移植中的AVR，以期利用蛋白转导技术为HO-1在抗排斥的临床应用上开辟新途径。

本资料结果显示，PTD-HO-1蛋白能有效延长协调性异种移植心脏的存活。根据各组移植心脏的病理表现，PTD-HO-1治疗组T细胞的浸润明显减轻，说明PTD-HO-1能明显抑制排斥中的炎症反应。当AVR发生时，随着异种T细胞的激活，继而产生IL-2和IFN-r等效应细胞因子。通过对各组血中细胞因子水平的检测，较之其他两组，术后48 h PTD-HO-1能明显抑制IL-2和IFN-r水平，表明PTD-HO-1可能通过抑制T细胞进而抑制相关细胞因子的表达。同时，通过对血清IgM的检测，发现移植后PTD-HO-1组抗体水平较其他两组更低，进一步证明该新型HO-1蛋白延长移植心脏存活时间的作用机制可能通过抑制早期体内IgM抗体的生成。另外，WB检测显示PTDHO-1组移植心脏内HO-1蛋白表达水平明显增高，由于作者是通过腹腔注射PTD-HO-1，因此其可能生效途径为PTD-HO-1诱导了供心的HO-1表达或PTDHO-1蛋白通过某种途径到达移植心脏内。在本资料中作者利用PTD-GFP荧光蛋白作为对照，通过对心脏切片的观察，并未在组织中发现绿色荧光，因此作者更倾向于认为PTD-HO-1通过影响受体从而诱导移植心脏HO-1表达的上升。

然而，该研究仍有一定的局限性，首先该新型蛋白的抗AVR机制并未得到完全的揭示，其次并未观察不同浓度PTD-HO-1蛋白对排斥的影响，另外该蛋白的毒副作用也未做进一步的观察。因此，有待更多研究进一步验证该蛋白功能。即使本实验存在众多的局限，仍验证了一种可行的HO-1应用途径，该新型蛋白能通过抑制供心T细胞浸润，抑制移植受体血清IL-2和IFN-r表达水平，抑制体内抗体IgM产生和促进移植心脏HO-1蛋白表达来延长协调性异种移植心脏的存活。作为一种可产量化的蛋白制剂，PTD整合型蛋白为HO-1的临床应用提出了新的思路。

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3 Ma J，Lau CK，Tsui TY，et a1.A ce11 penetrating heme oxygenase protein protects heart graft against ischemia/reperfusion injury .Gene Ther，2009，16（3）：320～328.

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Objective To investigate the inhibitory effect of a novel protein transduction domain（PTD）fused heme oxygenase-1（HO-1）protein on acute rejection of concordant cardiac xenograft，and its preliminary potential mechanism. Methods Stable concordant cervical cardiac xenotransplantation model of C57BL/6 mice to Wistar rats was successfully established. Randomly divided the transplanted rats into three groups：untreated group（control），PTD-GFP treated group（the rats were treated with 10mg/d PTD-GFP by intraperitoneal injection after transplantition）and PTD-HO-1 treated group（the rats were treated with 10mg/d PTD-HO-1 by intraperitoneal injection after transplantition）.The survival time of xenografts were measured and the xenografts were harvested at 48 hours after transplantation. The cardiac tissue structure were observed by haematoxylin-eosin staining. Infiltration of CD4+ T cells and CD8+ T cells in the cardiac xenografts were detected by immunohistochemistry. Expression of HO-1 in the cardiac xenografts was determined by Western blotting.The serum were collected at 48 hours after transplantition.Serum immune complex of IgM and inflammatory cytokines expression including IL-2 and TNF-α were measured by ELISA. Results Compared with the control group （2.67±0.52）d and PTD-GFP treated group（2.83±0.41）d，the survival time of xengrafts in PTD-HO-1 treated group（6.17±1.17）d improved significantly（P＜0.01）. At 48 hours after transplantition，the group treated with PTD-HO-1 exhibited lower degree of damagment in xenogragts tissue structure. And the infiltration of CD4+ T cell and CD8+ T cell in xengrafts were reduced with the treatmet of PTD-HO-1（P＜0.01）. Meanwhile，the group under PTD-HO-1 treatment result in a decrease in serum IgM，IL-2 and TNF-α campared with the other two groups（P＜0.05）. Furthermore，the protein level of HO-1 expression in xengrafts was increased with the treatment of PTD-HO-1 campared with the other two groups（P＜0.01）. Conclusions PTD fused HO-1 protein can significantly prolong concordant cardiac xenograft survival time.Protein transduction technique makes the application of HO-1 in clinical xenotransplantation for possible.

Protein transduction domain Heme oxygenase-1 Concordant cardiac xenograft Acute rejection

浙江省温州市科技计划项目（Y20140147）

325000 温州医科大学附属第一医院血管外科（郑祥韬戴驹骥 裘一辉 杨法镜 虞冠锋）

20246 德国汉堡大学UKE院校（徐东宇）