移植物动脉硬化模型大鼠血管平滑肌细胞原代培养及鉴定

张远标　尚敏杰　王知非　洪德飞　王伟林　郑跃英★

移植物动脉硬化模型大鼠血管平滑肌细胞原代培养及鉴定

张远标尚敏杰王知非洪德飞王伟林郑跃英★

目的 探讨大鼠腹主动脉移植后，血管平滑肌细胞（VSMC）的分离、培养方法。方法 建立BN至Lewis腹主动脉移植的慢性排斥反应、动脉硬化模型，60d后用组织块贴壁方法分离、培养血管平滑肌细胞并进行传代。采用形态学和肌动蛋白免疫组化鉴定证实为VSMC。结果 细胞呈典型的“峰-谷”样生长，历次传代鉴定均为高纯度VSMC，传代至6代左右仍能保持原有性状，细胞活力未见减低。结论 组织块贴壁法培养大鼠腹主动脉移植后VSMC具有操作简单、细胞活力高、纯度高等优点，可作为研究器官移植慢性排斥反应、移植物动脉硬化新的体外实验模型。

大鼠 腹主动脉移植 血管平滑肌 培养 组织块贴壁法

近年来器官移植短期存活率已经得到明显的提高，但慢性排斥反应导致移植物慢性失功，一直是影响移植物长期存活的主要原因之一［1～3］。慢性排斥反应具有一个共同的组织学表现即移植物动脉硬化［4］，其主要特征是血管平滑肌细胞（VSMC）增殖和细胞外基质增生所致的闭塞性动脉病变。临床上移植物3年动脉硬化的累积发生率达40%，5年则高达50%［5］，故深入研究移植物动脉硬化的发生机制，对防治移植物慢性失功具有重大意义。本课题通过建立移植物慢性排斥反应动脉硬化模型，原代分离培养血管平滑肌细胞，并进行纯化鉴定，为今后移植物慢性失功的防治提供新的思路和理想的体外实验模型。

1　材料和方法

1.1材料 （1）动物：实验大鼠为健康清洁级BN和Lewis大鼠，均为雄性，6～8周，体重165～220g，购于北京伟通利华实验动物技术有限公司。（2）主要器械和试剂：显微外科用显微镜，放大倍数10倍（Olympus），显微外科器械、常规外科手术器械以及8-0和11-0无损伤显微外科缝合线（均购于华东医疗器械有限公司），倒置显微镜（Olympus） 25cm2塑料培养瓶（Costar），优质胎牛血清（JRH公司），高糖DMEM（Gibco公司），抗平滑肌细胞α肌动蛋白单克隆抗体（Sigma公司）。100U/ml肝素生理盐水，100U/ml肝素乳酸林格氏液，1%戊巴比妥钠。

1.2大鼠腹主动脉移植慢性排斥动脉硬化模型的建立 根据Hillebrands等的报道［5］，建立BN→Lewis大鼠腹主动脉移植慢性排斥动脉硬化模型。（1）供体取材：BN大鼠称重后以1%的戊巴比妥钠按0.4ml/100g腹腔注射，备皮，常规消毒铺巾，依次切开皮肤、皮下肌层、腹膜，将胃肠推向右中下腹并用无菌湿纱布覆盖，充分暴露手术视野。手术过程中经常用温盐水滴湿纱布以防胃肠道干燥。消毒棉签钝性撕开腹膜后脂肪，显露下腔静脉和腹主动脉轮廓，打开动静脉鞘，锐性分离下腔静脉和腹主动脉，遇有血管分支时，11-0显微外科缝合线结扎离断。自左肾动脉分支到髂血管分岔处，完整游离腹主动脉。切取这一段长约1.5～2.5cm之腹主动脉，肝素生理盐水冲洗动脉管腔，放入100U/ml肝素乳酸林格液中，置于4℃冰箱。（2）腹主动脉移植：受鼠Lewis大鼠，完全分离腹主动脉步骤同（1），在两个止血夹之间切除长约1cm的腹主动脉，肝素生理盐水冲洗上下残端动脉腔。11-0缝合线采用间断缝合法行血管移植，一般每个吻合口各缝8～10针，边距0.3 mm，避免血管扭曲。吻合过程中，经常以肝素生理盐水冲洗管腔，避免空气进入。缝合结束，消毒棉签压迫2～3min，检查血管充盈情况。撤除纱布，观察无活动性出血，逐层关腹。腹腔内注射林格液20ml/kg，以恢复血容量［6］。

1.3 移植物血管平滑肌细胞的分离、培养 （1）细胞培养：术后60d断颈处死大鼠，75%酒精浸泡3min，移入超净台托盘内。十字切口剪开皮肤，换剪刀剪开腹壁及腹膜，消毒棉签拨开肠子，钝性暴露下腔静脉和腹主动脉，显微剪从近心端开始锐性分离下腔静脉和腹主动脉，剪下移植段血管，移入有预冷双抗PBS（青霉素100U/ml，链霉素100mg/ml）的玻璃培养皿内，左手持眼科镊夹住血管一端，右手显微弯镊撕下血管外脂肪、结缔组织和血凝块，冲洗2遍。移入另一个含高糖DMEM的玻璃培养皿内，显微镊仔细剥离动脉外膜。纵行剖开血管，消毒棉签或者眼科弯镊轻柔刮除血管内膜（图1A）。由于慢性排斥反应，内膜增厚，有时可以用显微镊直接撕脱，剩下的中膜组织较薄，透明、易横断。双抗PBS反复冲洗，以去除脂滴、血凝块等杂质以及可能残留的内皮细胞和外膜成纤维细胞。将中膜血管组织移入另一个含DMEM的玻璃培养皿中，眼科剪仔细剪成1mm×1mm大小的组织块（图1B），再次用双抗PBS冲洗2遍。用吸管吸取组织块，吹打至事先铺有鼠尾胶原（本实验室自制）的培养瓶底，均匀摆置，使组织块间距约0.5cm。直立培养瓶，加入20%胎牛血清的培养液5ml，盖好瓶盖，放入37℃培养箱内，使瓶底向上。0.5h后缓慢翻转培养瓶，使组织块完全浸入培养液，继续静置培养，换液1次/3d。动作轻柔，确保细胞游离出前组织块不脱落。（2）移植段血管VSMC的传代培养：待大部分组织块有细胞游离出并与周围细胞接触时，此时细胞大约长满培养瓶的70%～80%，便可进行传代。吸弃培养液，用PBS冲洗培养瓶底1次，加入0.25% 1ml胰酶，覆盖瓶底，放入37℃培养箱约2min后，倒置显微镜下见细胞触角回缩、细胞间隙增大时直立培养瓶，使细胞脱离消化液。吸弃胰酶，加入含有胎牛血清的培养液4～5ml终止消化并轻柔反复吹打，使细胞脱壁为单细胞悬液。吸取50%细胞悬液至新的培养瓶中，补足培养液（每瓶5ml左右）。如果初次传代过程中只有少数的组织块有细胞游离出，此时待组织块周围长满细胞，可以将细胞消化至六孔板中继续培养。因为在培养瓶中如果细胞密度过低，细胞不易成活。原代细胞首次胰酶消化时间较短，等传代数次后消化时间大致一样。脱落的组织块会随下次细胞换液、传代而除去。（3）VSMC的冻存和复苏：传代细胞次数过多可造成细胞衰老或者细胞性状的改变，因此需要在早期进行充足的冻存。细胞冻存前1d换液1次，以保证细胞有良好的状态。冻存时依次将冻存管置于4℃ 0.5h，-20℃2h，-80℃过夜，最后直接浸入液氮。建议冻存液的血清浓度＞50%，按此方法冻存的细胞复苏后成活率高，性状恢复较快，可较好的用于实验。

2　结果

2.1细胞生长形态 由于取材时鼠龄已较大，故细胞从组织块边缘游离出时间比国内学者报道要晚一些，一般在10～15d大部分组织块周围有细胞游离出，细胞形态不一，呈梭形、星形、多角形及不规则形，大小也略有差异（图1C）。细胞核多呈卵圆形，少数有双核或多核，核仁1个或者多个，胞浆丰富略透明，细胞相互之间常有突起连接。细胞簇之间连接成网状。原代细胞胞体较小，传代数次以后突起稍多，胞质伸展，细胞扁平，边界不清楚。当细胞长满时，可见典型的“峰-谷”样生长（图1E、F），“峰”处细胞较多，叠层，有时可达4～5层；“谷”处细胞层数较少，有时仅单层细胞甚至无细胞，此时也像“火山口”状（图1G）。传至6代，免疫组化见细胞性状无明显改变（×400）（图1H）。

2.2VSMC鉴定 采用单克隆小鼠抗-α-SM-actin免疫组化鉴定，证实＞95%细胞为血管平滑肌细胞：镜下观察染色后的细胞爬片，见胞浆中大量平行的丝条状染成棕黄色，细胞核不染色（图1D）。

3　讨论

慢性排斥反应移植物动脉硬化的发生是一个涉及VSMC功能及形态发生改变的多因素参与的过程［3，4］。VSMC是血管壁的主要细胞成分之一，是移植物动脉硬化发病中的主要效应细胞，其是决定血管活性和血管构型的重要因素，VSMC功能状态的改变在慢性排斥反应时移植物动脉硬化中发挥极其重要的作用。因此研究移植物慢性排斥反应动脉硬化VSMC的作用和功能变化，通过各种手段干预VSMC的活化与增殖，是目前治疗移植物慢性排斥反应具有重要价值的研究方向和研究热点［7］。

国外已经建立了多种VSMC细胞系［8］。平滑肌细胞培养方法常见的有酶消化法和组织块贴壁法。酶消化法常用的有胶原酶、弹力酶、透明质酸酶和胰酶等［9］，可以在短时间内得到大量的活细胞，但是采用此法需要的血管较多，胶原酶价格较高，操作步骤较多，污染的几率也相对增加。相比之下，采用组织块贴壁法培养大鼠VSMC具有操作简便、经济有效、重复性好等优点。

大鼠腹主动脉移植后血管平滑肌细胞的培养，与普通的大鼠血管平滑肌细胞的培养不同。后者使用的鼠龄较小，培养成活率较高；而前者因为构建慢性排斥反应模型需要近60d［5］，此时鼠龄较大，而且移植段血管较短（1.5～2.0cm），取材量受到限制。培养时需注意：（1）取材时尽量在移植段血管两端预留一点原受体血管组织，待内外膜剥离干净后再剪除，以免在操作过程中眼科镊直接夹伤移植段血管。（2）去除血凝块和结缔组织、PBS冲洗后直接将血管放在DMEM中剥离内外膜，以避免组织块的活力受损。（3）内外膜能否剥离干净是影响平滑肌细胞纯度的关键因素，外膜的剥离可以先在显微镜下练习，然后在肉眼下练习，最后在超净台内操作，逐渐达到熟练操作。动作要轻柔，避免牵拉过度。由于慢性排斥反应，内膜普遍增厚，容易辨认，因此内膜可以用棉签刮净，甚至可用显微镊整块撕除。（4）组织块尽量剪平整，1mm×1mm大小，摆放均匀。本实验发现，镜下边缘很光滑的组织块更易游出细胞。（5）翻瓶时间是本实验成败最关键的因素，时间越长，细胞游出所需时间越久。本实验使用鼠尾胶原预处理培养瓶，可以确保在30min之内翻瓶而且组织块不会漂起，而目前国内文献报道一般平均的翻瓶时间在4h左右［10］。实验证实，使用鼠尾胶原处理的培养瓶，平均10～15d就会有细胞游离，而使用未处理的培养瓶，4h翻瓶，几乎均在20d左右才能游离出细胞。（6）关于细胞纯化问题，国内有学者报道使用自然纯化法、机械刮除法、差异贴壁法等［11］。仔细分离外膜后，内膜由于排斥反应增厚容易分离，多次原代培养鉴定均为高纯度VSMC。国外学者也已经证明，即便早期有少许内皮细胞，随着传代次数的增加，VSMC的优势生长，内皮细胞会逐渐消失。

综上所述，组织块贴壁法培养大鼠腹主动脉移植后血管平滑肌细胞具有简便、经济、纯度高等优点，经形态学以及免疫组织化学鉴定均为高纯度VSMC。传代6代左右细胞形态性状未发生明显改变。早期冻存，复苏后继续传代生长，细胞性状不变。这为器官移植排斥、移植物慢性失功的基础研究提供了新的体外实验模型。

1 Sood S， Testro AG.Immune monitoring post liver transplant.World J Transplant，2014，4（1）：30～39.

2 van den Hoogen P，Huibers MM，Sluijter JP，et al. Cardiac allograft vasculopathy： a donor or recipient induced pathology.J Cardiovasc Transl Res，2015，8（2）：106～116.

3 Li J，Liu S， Li W，et al. Vascular smooth muscle cell apoptosis promotes transplant arteriosclerosis through inducing the production of SDF-1α. Am J Transplant，2012，12（8）：2029～2043.

4 Costello JP， Mohanakumar T， Nath DS.Mechanisms of chronic cardiac allograft rejection.Tex Heart Inst J，2013，40（4）：395～399.

5 Hillebrands JL，Rozing J.Chronic transplant dysfunction and transplant arteriosclerosis： New insights into underlying mechanisms. Expert Rev Mol Med，2003，5（2）：1～23.

6 Isik FF， McDonald TO， Ferguson M， et al. Transplant arteriosclerosis in a rat aortic model. Am J Pathol，1992，141（5）：1139～1149.

7 Beazley KE， Zhang T， Lima F， et al.Implication for transglutaminase 2-mediated activation of β-catenin signaling in neointimal vascular smooth muscle cells in chronic cardiac allograft rejection.J Heart Lung Transplant，2012，31（9）：1009～1017.

8 Kennedy E， Hakimjavadi R， Greene C， at al.Embryonic rat vascular smooth muscle cells revisited - a model for neonatal， neointimal SMC or differentiated vascular stem cells.Vasc Cell，2014，6（1）：6.

9 Ginnan R，Zou X，Pfleiderer PJ，et al.Vascular smooth muscle cell motility is mediated by a physical and functional interaction of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase IIδ2 and Fyn. J Biol Chem，2013，288（41）：29703～29712.

10 张呜号，王秀玉，曹军.组织块贴壁法原代培养人脐血管平滑肌细胞的改良.宁夏医科大学学报，2011，33（12）：1229～1231.

11 倪伟，刘涛，王浩宇，等.酶联合消化法培养小鼠主动脉平滑肌原代细胞.医学理论与实践，2013，26（13）：1681～1683.

To explore a method for isolating and culturing vascular smooth muscle cells （VSMC） after rat abdominal aortic transplantation. Methods The chronic rejection model of abdominal aortic transplantation was established using BN rats as donors and Lewis rats as recipients. Two months later，the allograft was harvested and VSMCs were isolated and cultured by explanting culture method. VSMC were identified by morphology and the immunohistochemical SABC method （α-SMActin）. Results The cultured VSMC showed typical “peak-valley” pattern and kept high purity and original activity after nearly 6 passages. Conclusion Tissue culture is a simple method for isolating and culturing VSMC after rat abdominal aortic transplantation，and the VSMC can remain high activity and high purity. It may provide a new model to study the chronic rejection and allograft arteriosclerosis in organ transplantation in vitro.

Rat Culture Tissue Culture Technique Abdominal Aortic Transplantation Vascular Smooth Muscle Cell

图1　A：移植段血管外膜与中膜可以清晰的剥离；B：血管剪成大小1mm×1mm组织块；C：贴壁15d，可见细胞自组织块边缘游出；镜下见：细胞形态不一，呈梭形、星形、多角形及不规则形，大小也略有差异（×200）。D：α-SMA肌动蛋白免疫组织化学检测结果（S-P法），＞95%的细胞呈阳性反应，即镜下观察染色后的细胞爬片，见胞浆中大量平行的丝条状染成棕黄色，细胞核不染色。细胞核多呈卵圆形，少数有双核或多核，核仁1个或者多个，胞浆丰富略透明，细胞相互之间常有突起连接（×400）。E-F：贴壁20d，可见细胞间相互融合生长，隐约可见“峰-谷”样生长（E×200，F×400）；G：传至6代，可见典型的“峰-谷”样生长，“峰”处细胞较多，叠层，有时可达4～5层；“谷”处细胞层数较少，有时只有单层细胞甚至无细胞，此时也像“火山口”状（×200）；H：传至6代，免疫组化见细胞性状无明显改变（×400）

310014 浙江省人民医院肝胆胰外科（张远标 尚敏杰王知非 洪德飞）

310003浙江大学医学院附属第一医院卫生部多器官联

合移植研究重点实验室（王伟林）

310003浙江大学医学院附属第一医院麻醉科（郑跃英）