16S rRNA基因检测在自发性细菌性腹膜炎早期诊断中的应用

张兴翔　金　敏

16S rRNA基因检测在自发性细菌性腹膜炎早期诊断中的应用

张兴翔金敏

目的 探讨16S rRNA基因检测在快速诊断自发性细菌性腹膜炎（SBP）中的临床应用价值。 方法 通过对细菌16S rRNA基因保守区和变异区的序列分析，设计通用引物，对已知实验室病原菌、人类基因组DNA、巨细胞病毒和白色假丝酵母菌进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，检测方法的特异性；采用倍比稀释法进行方法敏感性检测。对SBP患者的腹水同时进行PCR扩增和普通培养，比较两种方法的阳性率。结果 已知菌株均获得920bp 扩增产物，人类基因组 DNA、巨细胞病毒和白色假丝酵母菌无相应产物，敏感性能达到1pg 大肠埃希菌DNA。PCR法阳性率显著高于培养法（P＜0.05）。结论 PCR技术检测腹水病原菌16S rRNA基因，具有特异性强，敏感度高等特点，在早期、快速诊断SBP方面具有重要临床应用价值。

16S rRNA基因 聚合酶链反应 自发性细菌性腹膜炎

自发性细菌性腹膜炎（SBP）是肝硬化失代偿期和重型肝炎常见的严重并发症，也是导致肝功能恶化的常见原因之一，SBP能导致病情恶化和患者死亡，在临床积极治疗下病死率仍高达20%～30%。因此，早期、快速诊断和及时治疗是挽救患者生命的关键［1］。传统的腹水培养法耗时长，阳性率较低，16S rRNA基因检测方法具有检测耗时短、阳性率高等优点，现报道如下。

1　临床资料

1.1一般资料 选择本院感染科和消化内科2012年1月至2014年12月间住院疑似SBP患者49例。其中男28例，女21例；年龄37～82岁，平均年龄（56.0±14.5）岁。诊断标准参照2000年西安全国传染病与寄生虫病会议制订的标准［2］。

1.2标本来源 在无菌条件下抽取腹水20ml，10ml接种于培养瓶用于普通细菌培养，10ml保存于-20℃冰箱。

1.3引物设计与合成 引物由上海生物工程公司合成： 上游为 5 ＇AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3 ＇；下游 为 5 ＇ CCGTCAATTCCTTTGAGTTT 3＇，扩增产物长度为920bp。

1.4试剂与仪器 聚合酶链式反应（PCR）反应试剂由大连宝生物工程公司提供，PCR仪为PE公司提供，DYY-III型稳压稳流电泳仪由北京六一仪器厂提供，Gel doc 1000成像系统由美国 Bio-Rad 公司提供。

2　结果

2.1PCR方法特异性分析 8株已知病原菌经PCR方法扩增后均获得920bp的扩增产物，但人类基因组DNA、巨细胞病毒、白色假丝酵母菌和空白对照无相应产物，见图1。

图1　已知病原菌PCR扩增后产物电泳图

2.2 PCR方法的敏感性分析 已知浓度的大肠埃希菌DNA经无菌水10倍倍比稀释后经PCR方法扩增，最低浓度可达1pg。

2.3两种方法的阳性率比较 培养法阳性率为14.29%，PCR方法阳性率为36.73%，PCR方法阳性率显著高于培养法（P＜0.05），见表1。

表1　两种方法敏感性比较（n）

3　讨论

SBP是指无腹腔脏器穿孔、炎症或损伤而发生的急性细菌性腹腔感染，肠道病原菌过度繁殖、肠黏膜屏障破坏、宿主免疫功能缺陷是SBP发生的三大危险因素。目前，SBP的确诊主要依据是腹水病原菌培养和腹水实验室常规检查，但SBP腹水细菌培养阳性率较低，即使腹水中性粒细胞计数≥ 0.25×109/L的腹水，其培养阴性率也高达65%，并且培养法耗时较长，一般需要3～5d［3］。近年来，随着分子生物学发展，16S rRNA基因检测技术在医学方面的广泛应用，使其在SBP患者腹水病原菌快速检测中成为一种重要方法。

16S rRNA基因序列结构完整，总长度适中，存在于所有细菌基因组中，不存在于病毒、真菌等非原核生物中。因此，在细菌学研究中16S rRNA基因常被作为研究的靶分子。李庆等［4］将16S rRNA基因检测技术应用于新生儿败血症早期诊断，细菌培养法阳性率为11.3%，PCR方法阳性率为26.8%，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。邱建达［5］应用16S rRNA基因检测慢性前列腺炎患者前列腺液中病原菌，细菌培养法为10.31%，PCR方法检测阳性率为59.79%，PCR方法敏感性显著高于传统的培养法。汪峰等［6］运用16S rRNA 宽范围聚合酶链反应快速检测临床无菌体液标本，PCR方法阳性率为15.9%，培养法阳性率为9.6%，16S rRNA 宽范围 PCR方法具有敏感性高、特异性强等优点。潘红英等［7］用定量PCR联合基因芯片技术检测SBP患者腹水中细菌16S rRNA基因诊断自发性细菌性腹膜炎，细菌培养法阳性率为7.9%，PCR方法阳性率为22.4%，PCR方法阳性率显著高于细菌培养法，并且PCR方法能将病原菌区分为革兰阳性或革兰阴性菌，有利于临床针对病原菌及时经验用药。骆欢等［8］应用PCR技术检测肝硬化患者腹水标本，细菌培养法阳性率为5.41%，PCR方法阳性率为24.32%，PCR方法阳性率显著高于细菌培养法阳性率（P＜0.05）。本研究结果表明，16S rRNA基因检测技术检测SBP患者的腹水标本阳性率为36.73%，普通细菌培养法阳性率为14.29%，16S rRNA基因检测技术阳性率显著高于细菌培养法（P＜0.05），其检测下限低至1pg 大肠埃希菌DNA，达到临床要求。

总之，16S rRNA基因检测技术在快速诊断SBP具有特异性强，敏感性高等特点，在早期、快速诊断SBP方面具有重要临床应用价值。

1 Riggio O，Angeloni S. Ascitic fluid analysis for diagnosis and monitoring of spontaneous bacterial peritonitis. World J Gastroenterol，2009， 15（31）：3845～3850.

2 中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会.病毒性肝炎防治方案.传染病信息，2000，13（4）：141～142.

3 Wiest R，Krag A，Gerbes A.Spontaneous bacterial peritonitis： recent guidelines and beyond.Gut，2012，61（2）：297～310.

4 李庆，王涛，范春燕，等.16S rRNA基因检测在新生儿败血症早期诊断中的应用. 中华医院感染学杂志， 2012，22（21）：4696～4697.

5 邱建达. PCR技术在前列腺液细菌检测中的应用. 中华医院感染学杂志， 2012，22（7）：1535～1537.

6 汪峰，刘彩林，廖亚龙，等.应用16S rRNA 宽范围聚合酶链反应快速检测临床无菌体液感染.检验医学，2011，26（12）：865～868.

7 潘红英，谌翠容，尚世强，等.定量PCR联合基因芯片检测腹水细菌16SrRNA诊断自发性细菌性腹膜炎.中华肝脏病杂志，2011，19（4）：297～300.

8 骆欢，李国航，瞿志军，等.应用16S rRNA基因研究肝硬化患者肠道和腹水中菌群分布.当代医学，2011，17（23）：5～6.

Objective To explore the clinical application value of detection 16S rRNA gene in the rapid diagnosis of spontaneous bacterial peritonitis（SBP）. Methods Universal primers were designed through a known pathogen of a conservative district and variation of 16S rRNA gene sequence analysis. The specifi city was detected through PCR amplifying known pathogen，human genomic DNA，cytomegalovirus and Candida albicans.The sensitivity was detected through doubling dilution. The ascites were done by PCR Method and culture Method at the same time，the positive rate was compared by the two Method s. Results The known pathogen were amplifi ed and products were 920bp，but human genomic DNA，cytomegalovirus and Candida albicans showed no corresponding products. Sensitivity showed that it could detect as low as 1 pg of Escherichia coli. DNA.The positive rate of PCR Method was signifi cantly higher than that of culture Method（P＜0.05）. Conclusion The technology of PCR has strong specifi city and high sensitivity，it has important clinical application value in early and rapid diagnosis SBP.

16S rRNA gene Polymerase chain reaction（PCR） Spontaneous bacterial peritonitis（SBP）

310000 杭州市西湖区第二人民医院

1.5反应体系和条件 PCR反应体系为2.5mmol/L dNTPs 4μl，25 mmol/L Mgcl24μl，10×Buffer 5μl，20μmol/L引物各1μl，5U/μl Taq酶0.25μl，模板5.0μl，加无菌双蒸馏水至50μl。反应条件为：94℃预变性6min，94℃变性45s，54℃退火lmin，72℃2min共循环30次，最后延伸10min。

1.6扩增产物分析 将扩增产物2μl与1μl上样缓充液混匀后，加样于1.5%琼脂糖凝胶（含溴化乙锭），经100V电压电泳30 min，将电泳后的琼脂糖凝胶放置在凝胶图像分析仪上，紫外线透射扫描观察并拍照保存。

1.7统计学方法 采用SPSS14.0统计软件。计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。