母婴分离大鼠脑-肠轴内P物质及其NK1受体的表达

滕卫军　丁明星　方远书　方马荣

母婴分离大鼠脑-肠轴内P物质及其NK1受体的表达

滕卫军丁明星方远书方马荣

目的 研究P物质及其受体在新生期母婴分离大鼠模型脑-肠轴上的表达。方法 将新生期Sprague-Dawley雄性大鼠随机分为两组：母婴分离组：在出生后第2～21天，使新生大鼠与哺乳期母鼠分离3h/d。对照组：在出生后第2～21天，不给予任何处理。成年后（出生后60d）给予结直肠球囊扩张（CRD），取远端结肠、腰骶段脊髓和中脑进行P物质和NK1受体免疫组化检测并定量分析。结果 母婴分离组大鼠和对照组比较，结肠肌层P物质阳性面积百分数、结肠NK1受体阳性肌间神经丛数目、脊髓背角P物质阳性面积、脊髓背角NK1阳性分布积分、中脑导水管周围灰质（PAG）和中缝核（DR）内P物质阳性面积、中脑PAG和DR内NK1阳性分布积分差异均无统计学意义（P均＞0.05）。结论 新生期母婴分离对 P物质和NK1受体表达的影响不明显，P物质和NK1受体在母婴分离大鼠模型内脏感觉过敏发生机制中的作用可能不大。

内脏感觉过敏 新生期母婴分离 P物质 NK1受体

P物质是一种神经肽，包含11个氨基酸，属于速激肽家族中的一员。NK1受体对P物质有高亲和力。P物质和NK1受体在肠道和脊髓及脑中发挥作用，可能参与内脏痛觉过敏的外周和中枢机制［1］。深入开展内脏感觉过敏机制的研究必须建立在肠易激综合征（IBS）内脏感觉过敏的动物模型基础上，而新生期母婴分离对大鼠是一种早期生活事件，可致幼鼠包括局部脑血流和可塑性变化等神经-内分泌的变化及脑-肠轴的改变［2］，具有内脏痛觉过敏和应激后结肠运动加强等表现，能较好模拟IBS患者的主要特征［3］。考虑到P物质和NK1受体在内脏痛和痛觉过敏中的作用，本实验以新生期母婴分离大鼠模型为研究对象，检测结肠和脊髓及中脑水平P物质和NK1的分布和表达，报道如下。

1　材料和方法

1.1动物分组 将出生后第1天的新生大鼠Sprague-Dawley雄性大鼠（由金华市实验动物中心提供）随机分为两组：母婴分离组（16只）和对照组（16只），每笼8只新生大鼠，然后将哺乳期母鼠随机分配给每笼，使每笼包括8只新生大鼠和1只哺乳期母鼠。母婴分离组：在出生后第2～21天，将新生大鼠与哺乳期母鼠分离3h/d。对照组：在出生后第2～21天，不给予任何处理。饲养环境：每周半量换木屑垫料，出生后第22天断奶，第30天分笼，每笼4只大鼠。昼-夜循环（6：00开灯，18：00关灯），自由饮水饮食，室温（20±1）℃。直到出生后60d（体重280～320g）进行其它操作。所有的实验程序按照实验动物批准协议进行。

1.2新生期母婴分离 在出生后第2～21天，每天将新生大鼠与哺乳期母鼠分离3h。具体操作如下：早上9：00开始，将哺乳期母鼠从笼中拎出放入另一个单独的笼中；然后将新生大鼠作为一个整群（每群8只）从笼中移出，放入另一个单独的笼中（笼内铺有3cm厚的木屑垫料），再将此笼转移至隔壁房间，温度为室温（20±1）℃；3h后，将新生大鼠放回最初笼中，使之在垫料上翻滚，然后将哺乳期母鼠放回。

1.3结直肠球囊扩张（CRD） 大鼠成年后（出生后60d）进行结直肠球囊扩张：大鼠经2%异弗醚（含氧量为0.2L/min）麻醉后，将石蜡油润滑后带气囊的8F导尿管经肛门插入约6cm，用胶带纸将导管缠绕固定在大鼠尾根部，导管经三通管连接10ml注射器和汞柱式血压计，使球囊内压力（代表结直肠内压力）得以实时监控。然后将大鼠放在塑料平台上（30cm×20cm），使之苏醒并适应环境30min后，经注射器注气给予结直肠球囊快速时相性压力扩张，分别给于10、20、40、60和80mmHg扩张压力。即快速注气使球囊压力达到10mmHg，维持此压力20s，然后抽出气体使球囊内压力降至0，4min后重复上述扩张过程，同理依次分别给予20、40、60和80mmHg扩张压力。

1.4免疫组化检测P物质和NK1受体在结肠和脊髓及中脑的免疫反应分布和表达 组织获取：结直肠扩张后，成年大鼠经腹腔注射7%水合氯醛（35mg/100g体重）麻醉后，经左心室灌注0.85%生理盐水约100ml，继续灌注4%多聚甲醛磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.4）约300ml。取远端结肠（距肛门5～6cm）、腰骶段脊髓（L6～S1）及中脑后固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中，置于4℃冰箱中过夜，然后将组织浸于25%蔗糖磷酸缓冲液中约24～48h，之后将组织冷冻包埋于OCT复合物。在-20℃恒温冷冻切片机中切片，结肠切片厚15μm，脊髓及中脑切片厚40μm，分别用免疫荧光标记方法进行漂染。结肠、脊髓及中脑切片的免疫荧光标记方法、步骤如下：漂洗切片于0.01mol/L的PBS缓冲液中2×10min；孵育切片于包含0.3%Triton x-100和10%正常山羊血清的PBS缓冲液中30min；去除上述阻断液（不要漂洗）；孵育切片于一抗溶液中（小鼠抗大鼠P物质抗体，购自abcam公司，稀释度为1：500；兔抗大鼠NK1受体抗体，购自Sigma公司，稀释度为1：200，均稀释于含0.3%Triton x-100和5%正常山羊血清的PBS缓冲液中）室温下过夜；漂洗切片于0.01mol/L的PBS缓冲液中3×10min；分别孵育切片于不同二抗溶液中（FITC标记的兔抗小鼠IgG抗体，TRITC标记的山羊抗兔IgG抗体（购自Sigma公司），稀释度为1：500，稀释于含0.3%Triton x-100和5%正常或兔山羊血清的PBS缓冲液中）室温下2h；漂洗切片于0.01mol/L的PBS缓冲液中3×10min；将切片用50%甘油（甘油和PBS缓冲液等体积混合）裱于经APES处理过的载玻片上，盖上盖玻片。免疫标记后，切片用Zeiss Axiophot 2显微镜（德国）观察，用数码相机及其配套软件Spot 32（美国）摄取图像，FITC在（激发470nm，释放520nm）激发下发出绿光，图像获得后，用Metamorph4.0软件（美国）进行图像定量分析。所有分析由一个对实验分组和处理情况不知情的分析者完成。P物质在结肠肌层中的阳性面积百分数（即阳性面积占肌层面积的百分数）：在5×物镜视野下获取结肠切片图像，用Metamorph4.0软件进行分析，将图像放大至原图像的200%，设置灰度阈值，超过此阈值的灰度被确定为阳性，再选定整个肌层范围，可得到选定肌层范围的面积和此范围内阳性面积，用肌层范围内阳性面积除以肌层面积，得到肌层中P物质阳性面积百分数。P物质在脊髓背角或中脑的阳性面积：在10×物镜视野下获取整个脊髓背角或中脑的图像，用Metamorph4.0软件进行分析，设置灰度阈值，超过此阈值的灰度被确定为阳性，得到双侧背角或中脑导水管周围灰质（PAG）及中缝背核（DR）的P物质阳性面积，结果表示为μm2/双侧背角或μm2/中脑PAG及DR。NK1受体阳性肌间神经丛的数目：在20×物镜视野下观察计数整个切片中阳性肌间神经丛的数目。NK1受体在脊髓背角或中脑的表达：NK1受体免疫反应在脊髓背角的分布范围用半定量评分来衡量，因为NK1免疫反应分布于Ⅰ层、Ⅲ～Ⅴ层、靠近中央管的Ⅹ层或中脑PAG及DR等区域，设定评分标准：一个区域有免疫反应为1分；两个区域有免疫反应为2分；三个区域有免疫反应为3分；更多区域有免疫反应为4分。

1.5统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，NK1受体在脊髓背角或中脑的表达用Mann-Whitney U非参数检验，其它指标均数间的比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1结肠中P物质免疫反应的分布和表达 在大鼠结肠中，P物质免疫反应性主要分布于肌层，环肌层有P物质阳性神经纤维，肌间神经丛有P物质阳性神经元和纤维；黏膜下层也有P物质免疫反应性。定量分析发现，母婴分离组和对照组在CRD前后，肌层P物质阳性面积百分数在各组间无明显差异（P＞0.05）（表1）。

2.2结肠中NK1受体免疫反应的分布和表达 结肠中NK1受体免疫反应主要存在于肌间神经丛。定量分析发现，母婴分离组和对照组在CRD前后，NK1受体免疫反应阳性肌间神经丛数目无明显差异（P＞0.05）（表2）。

2.3脊髓背角P物质免疫反应分布和表达 P物质免疫反应分布于脊髓背角浅层。定量分析发现，母婴分离组和对照组在CRD前后，脊髓背角P物质阳性面积无明显差异（P＞0.05）（表1）。

2.4脊髓背角NK1受体免疫反应的分布和表达 NK1受体在脊髓背角广泛分布，浓集分布于浅层，在深层和靠近中央管区域有阳性神经元和突起。定量分析发现，母婴分离组和对照组在CRD前后，脊髓背角NK1受体分布积分无明显差异（P＞0.05）（表2）。

2.5中脑PAG及DR的P物质免疫反应分布和表达 P物质免疫反应分布于中脑PAG及DR。定量分析发现，母婴分离组和对照组在CRD前后，中脑PAG及DRP物质阳性面积无明显差异（P＞0.05）（表1）。

表1　母婴分离组和对照组大鼠脑肠轴P物质的表达（x±s）

表2　母婴分离组和对照组大鼠脑肠轴NK1受体的表达（x±s）

2.6中脑PAG及DR的NK1受体免疫反应的分布和表达 NK1受体在中脑PAG及DR散在分布，有阳性神经元和突起。定量分析发现，母婴分离组和对照组在CRD前后，中脑PAG及DRNK1受体分布积分无明显差异（P＞0.05）（表2）。

3　讨论

P物质和NK1受体在内脏痛传输和调节方面起重要作用。鉴于P物质在伤害性刺激时被初级感觉神经释放至外周（肠）和中枢（脊髓及脑干），在外周参与致痛，在中枢参与致敏，而且外周炎症时脊髓背角和肠壁中P物质和/或NK1受体的表达量发生改变，NK1受体拮抗剂对炎症和应激所致内脏感觉过敏起抑制作用，因此本实验检测了内脏伤害性刺激（CRD）时结肠和脊髓及中脑水平P物质和NK1受体的分布和表达。结果显示，在结肠肌层（包括肌间神经丛）中，P物质和NK1受体的分布和表达量在母婴分离组和对照组无明显差异。肠道中的P物质大多来自内在肠神经，少数来自外在感觉神经（迷走和脊髓感觉神经）纤维，后者将内脏信息传递至中枢神经系统［4］，从本实验结果难以判断外在感觉神经纤维中P物质的分布和表达有无改变。外在初级感觉神经的细胞体位于背根神经节和节状神经节，这些神经元有无P物质表达的改变有待研究。

在脊髓背角及中脑PAG及DR，母婴分离组大鼠P物质和NK1受体免疫反应的分布及表达和对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），提示在脊髓及中脑水平P物质的释放和NK1受体的激活在母婴分离组大鼠和对照组大鼠可能无明显差异。

总之，本实验结果发现：母婴分离组大鼠在结肠扩张前后，其结肠和脊髓背角及中脑P物质和NK1受体免疫反应的分布和表达与对照组比较均未见明显差异，对此结果的可能解释有：（1）IBS是一种功能性疾病，目前还未发现特异性的生化和结构异常，国内有报道IBS患者肠道黏膜中P物质免疫反应神经纤维表达增加［1，5］；但最近发现感染后IBS患者结肠黏膜P物质表达增加，而非感染IBS患者结肠黏膜P物质表达与对照组无明显差异［6］。而且P物质和NK1受体主要在炎症相关伤害性感受中起作用，这方面的证据来自P物质和NK1受体在炎症过程中的表达改变，NK1受体拮抗剂对炎症所致内脏感觉过敏动物模型的作用和基因敲除小鼠对炎症所致内脏伤害性感受的缺陷［7］。而本动物模型是以中枢神经机制（新生期心理应激）为主介导的模型，无感染/炎症的发生和参与，这可能是本动物模型无P物质和NK1受体改变的原因之一。（2）本实验在结肠和脊髓及中脑3个层面检测了P物质和NK1受体的表达，其在脑的表达有无改变及具体部位尚不清楚。中枢神经系统P物质通路在内脏高敏感大鼠直肠扩张刺激时被激活，血浆及脊髓上部位P物质含量发生改变［8］，可能通过杏仁核，海马和前扣带回等部位激活而起效应，但也有发现IBS患者皮层和皮层下区的广泛区域的P物质和NK1受体的失调不甚明显［9］。因此，本母婴分离动物模型中脊髓及中脑有无P物质和NK1受体的改变有待进一步研究。

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2 Bian ZX.Novel insights about the mechanism of visceral hypersensitivity in maternally separated rats.Neurogastroenterol Motil，2012，24（7）：593～6.

3 Coutinho SV，Plotsky PM，Sablad M，et al.Neonatal maternal separation alters stress-induced responses to viscerosomatic nociceptive stimuli in rat.Am JPhysiol Gastrointest Liver Physiol，2002，282（2）：G307～G316.

4 Holzer P， Holzer-Petsche U. Tachykinins in the gut. Part I. Expression，release and motor function.Pharmacol Ther，1997， 73（3）： 173～217.

5 王艳杰，王德山，关洪全，等.眼针对肠易激综合征大鼠血清和结肠组织中P物质及血管活性肠肽含量的影响.针刺研究，2010，35（1）：8～11.

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8 Liang C，Luo H，Liu Y，et al.Plasma hormones facilitated the hypermotility of the colon in a chronic stress rat model.PLoS One，2012，7（2）：e31774.

9 Jarcho JM，Feier NA，Bert A，et al.Diminished neurokinin-1 receptor availability in patients with two forms of chronic visceral pain.Pain，2013，154（7）：987～996.

Objective To study the expression and distribution of substance P and its receptor along brain-gut axis in neonatal maternal separation rats. Methods Male neonatal Sprague-Dawley rats were randomly divided into 2 groups： Maternal separation（MS）group exposed to a 3-hour daily maternal separation or Non-handling（NH）control group exposed to no handling on postnatal day 2-21. Colorectal distension（CRD）was performed in these rats in adulthood. Distal colon and lumbar-sacral spinal cord and midbrain were harvested for semi-quantitative analysis of substance P and NK1 receptor expression using immunohistochemical methods before and after CRD. Results None of the elements of substance P system was altered by maternal separation. There was no significant difference in substance P positive area percentage、the number of NK1 receptor positive myenteric plexus、substance P positive area in dorsal horn、the NK1 positive score in dorsal horn、periaqueductal gray（PAG）and raphe nucleus（DR）of midbrain 、the NK1 positive score in PAG and DR（P＞0.05）. Conclusion s Neonatal maternal separation has no significant effect on the expression of substance P and NK1 receptor，suggesting that substance P system play little role in the development of visceral hyperalgesia in neonatal maternal separation rat models.

Visceral hypersensitivity Neonatal maternal separation Substance P NK1 receptor

浙江省科技厅实验动物科技计划项目（2012C37032）

321000 浙江大学金华医院内镜中心（滕卫军）

321007金华职业技术学院医学院（丁明星）

321000 浙江省金华市实验动物中心（方远书）

310058 浙江大学神经科学研究所（方马荣）