基于荧光图像的快速检测藻类浓度方法的研究

徐元哲，徐云升，谢鑫刚，吴路光，吕健威

(1.琼州学院电子通信学院，海南三亚572020;2琼州学院食品学院，海南三亚572020;3.东北电力大学自动化工程学院，吉林吉林132013)

由于世界经济的迅速发展，水体富营养化程度加剧，导致藻类大量繁殖，造成了水体环境生态的破坏，另一面浮游植物是海洋中重要的初级生产者和能量的转换者。研究浮游植物的含量分布监测对于海洋生态的评估及海洋生物资源的开发均有实际意义［1，2］，因此国内外很多学者对藻类浓度测量进行了研究［3－7］。

一般采用测量水体中叶绿素a浓度的方法来获取海洋中浮游植物的浓度。检测叶绿素a浓度的方法目前有分光光度法、高效液相色谱法、实验室荧光光谱法和遥感法。这些方法各有利弊，本文论述利用荧光图像检测藻类的一种新方法，这种方法的优点就是可以实现快速检测，本检测装置适用于无人驾驶船船载检测。

1 系统检测原理

(1)当特定波长的光子碰撞到叶绿素分子时，光子被分子吸收，使分子的能量升高;处于较高能态的分子是不稳定的，要通过释放吸收的能量而回到稳定的基态即最低能级，其中一部分能量以热辐射的形势耗散，另一部分以荧光的形势释放出来。分子必须在吸收一定频率范围的激发光后，通过振动弛豫回到第一激发电子态的最低能级，由此向下的辐射跃迁才可能产生荧光［8，9］。如图1所示为某一种绿藻叶绿素a的激发光谱和荧光发射光谱。我们可以清晰地看到，当激发光中心波长为435 nm时，叶绿素a发出峰值荧光波长为685 nm的荧光。

图1 叶绿素a的激发光光谱和荧光发射光谱

(2)如图2所示，激光垂直入射到装有浓度为c的叶绿素a溶液时，设激光入射光强为I0，摩尔吸收系数为ε，激光达到溶液的不同深度时的光强为I，则

图2 激光激发叶绿素产生荧光的示意图

设Q为物质荧转化率，F=QI，式中F1为被激发的荧光强度I为激发光光强，在弱光前提下认为物质荧光转化率与物质浓度呈线性关系，即Q=Kc。K值为常数，则在x处产生的荧光强度为

此处荧光强度达到液体表面的光强为

在垂直入射方向上看荧光光斑就是不同深度产生的荧光光斑强度传播到液体表面，在液体表面进行累加。用F代表荧光光斑在液体表面光强的累加的结果，液体的深度设为L，即

εcL≪1时

即浓度c与荧光灰度F之间存在线性关系。

激发光光强，摩尔吸收系数一定的情况下产生的荧光光强与叶绿素浓度有关与样品池中液体的高度有关。本文就是通过实验确定入射光光强与样品池液体高度，使叶绿素a浓度与产生的荧光灰度之间成线性。

2 系统方案设计

近海藻类监测装置有高性能窄带激励光源系统、CCD摄像系统和DM642图像处理系统三大部分组成。系统总的检测流程是激光驱动电路驱动激励光源产生激光，激光打入不同浓度的藻类实验样品中，藻类产生荧光反应，CCD摄像机进行荧光图像采集，然后图像进入DM642图像处理系统中，最后得到处理后的信息显示。如图3为系统的检测流程图。

图3 系统的检测流程图

2.1 光源系统

光源采用435 nm波长总功率为150 mw的紫色激光器［10］。激光器的恒流驱动电路如图4所示。其工作原理如下:通过R1和R2分压，给运算放大器正相输入端一个偏置电压V，有运算放大器输入端对电压虚短、电流虚断的原理可知，运算放大器的反向电压也为V，也就是三极管的发射极的电压为V，发射极对于地只有一个电阻R4，由于流过三极管基极的电流可以忽略不计，所以流过激光器LD电流就是I=V/R4，与接入的负载无关。在光源的驱动模块中设计的还有LD光源的TTL调制电路，可以调节激光器的功率输出大小［11，12］。

2.2 CCD摄像系统

CCD摄像系统有CCD摄像头、镜头和荧光滤光片三部分组成。CCD摄像头选用的是高清SONY－CCD700线的摄像头，荧光滤光片采用685nm的窄带干涉滤光片，使在图像接收部分，保证接收的荧光在685±5 nm范围内。

2.3 DM642图像处理系统

图像处理系统是系统的核心，影响着系统的工作效率和速度，因此选用的TMS320DM642开发板，在图像处理中，先对藻类产生的荧光图像进行采集，由于采集的图像是YUV彩色图像［13］。因此需要将其转化为灰度图像。YUV(亦称YCrCb)是被欧洲电视系统采用的一种颜色编码方法，它属于PAL制，其中Y表示明亮度，也就是灰阶值;U和V表示的是色度，作用是用来描述影像色彩及饱和度，用来指定像素的颜色。因此，我们只需提取Y通道中的信号就能得到与之对应的灰度图像［14，15］。

然后再进行对荧光图像进行去噪处理，去噪处理的算法采用图像的加权平均法－图像平滑方法，也就是用像素的某邻域内诸像素灰度的加权平均值来代替原像素的灰度值［16］，从而达到消除噪声的干扰。平滑处理完成后对图像中的荧光点进行灰度值读取，根据灰度值的大小来反应出藻类浓度的大小。图5为实验装置图。

图4 激光器的恒流驱动电路

图5 实验装置图

3 实验结果分析

(1)不同激发功率时叶绿素a浓度与荧光图像灰度之间的关系。

图6为检测液面高度为10 cm，从下到上为激发功率为15 mw，30 mw，60 mw，90 mw，120 mw，150 mw时的叶绿素a浓度与荧光灰度之间的关系。激发功率为15mw时在本实验条件下基本上符合线性规律，即符合在弱光前提下的理论关系。对于其他强光激发下随着浓度的增加灰度值趋于饱和。

(2)不同液体高度下浓度与荧光图像灰度之间的关系。

图7为激励光源功率输出为15 mw时，从上到下样品池的高度分别为25 cm，20 cm，15 cm和10 cm时的叶绿素a浓度与荧光图像灰度值之间的关系。根据公式(6)可知εcL因子决定叶绿素a与荧光图像灰度值的线性关系，因此ε一定的情况下，L值越大线性度就越差，根据公式(7)可知L值越大灵敏度就越大，但是L越大线性度越差，在选择L时保证线性度的情况下，尽量要选择灵敏度大的L。由实验可知检测样品池液体高度的高度等于10 cm时基本成线性直线，而且灵敏度相对大。因此在本实验条件下高度等于10 cm时为最佳测量条件。

由实验可知检测样品池液体高度的高度小于10 cm并激光器的功率选择小于15 mw时基本成线性直线，因此也为最佳测量条件。

图6 不同激光功率下浓度与灰度值之间的关系

(3)不同浓度叶绿素a的荧光图。

不同浓度叶绿素a产生的荧光灰度图见图8。通过图可以看出随着叶绿素a浓度的增加，荧光图像逐渐变亮，其灰度值逐渐变大。

(4)标准荧光光度计测量值与荧光图像灰度值之间的关系。

样品液体高度为10 cm、激发功率为15 mw时，检测到的荧光图像灰度值与岛津RF－5301PC荧光分光光度计测量值的关系曲线(见图9)。从曲线可以看出有较好的线性。线性关系为y=0.1017x－5.0451，线性误差为6.091%。

图7 不同高度下的浓度与灰度之间的关系

图8 不同浓度叶绿素a的荧光图

图9 标准荧光光度计测量值与荧光图像灰度值之间的关系

4 结论

本文通过实验确定了荧光图像法测量藻类叶绿素a的最佳激光激发功率，并给出了样品池液面高度确定的实验方法。通过实验可知，激光激发功率采用小于15 mw样品池的高度小于10 cm时线性度较好，并与标准的荧光光度计进行比较结果有较好的线性关系。该方法最大优点是可快速检测藻类叶绿素a的浓度。

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