广西扶绥县人群DDX39基因单核苷酸多态性与肝癌家系遗传易感性的关系

时间：2024-08-31

任爱华廖燕韦柳君赵瑞强魏斐斐谢裕安

作者单位：530021 南宁1广西医科大学附属肿瘤医院广西壮族自治区肿瘤防治研究所；2国家生物靶向诊治国际联合研究中心广西生物靶向诊治研究重点实验室广西肿瘤靶向诊治协同创新中心广西高校生物传感重点实验室；3广西医科大学研究生学院；4广西医科大学第三附属医院南宁市第二人民医院；5广西医科大学生物化学与分子生物学教研室

基础研究

任爱华1，2，3廖燕4韦柳君1，2，3赵瑞强5魏斐斐1谢裕安1

目的探讨广西扶绥县原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，以下简称“肝癌”）高发家系人群DDX39基因rs12461754位点单核苷酸多态性与肝癌遗传易感性的相关性。方法选取广西扶绥县20个肝癌高发家系共77例和10个正常对照家系共35名为研究对象，采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术（matrix assisted laser desorption ionization-time of fight-mass，MALDI-TOF-MS）检测DDX39基因rs12461754位点在两组中的基因型和等位基因频率。结果正常对照家系组人群DDX39基因rs12461754位点携带A等位基因型的个体发生肝癌的风险是G等位基因型个体的0.407倍（95%CI：0.125～1.326，P=0.136）；在肝癌高发家系非肝癌组人群中，携带A等位基因型的个体发生肝癌的风险是G等位基因型个体的0.981倍（95%CI：0.298～3.326，P=0.976）；DDX39基因rs12461754位点GG、AG、AA基因型在肝癌高发家系肝癌组、肝癌高发家系非肝癌组及正常对照家系组三组间相互比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论DDX39基因rs12461754位点单核苷酸多态性与广西扶绥县肝癌家系遗传易感性无明显相关性。

肝肿瘤；DDX39基因；单核苷酸多态性；遗传易感性

原发性肝癌是全球高发的恶性肿瘤之一，中国新发病例数及死亡病例数均占全球50%左右，居世界首位［1］。我国原发性肝癌发病率较高，居恶性肿瘤发病率第三位，而死亡率位居我国恶性肿瘤死亡率第二位［2］，且90%以上的肝癌为原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，以下简称“肝癌”）［3］。广西扶绥县是我国肝癌高发区之一［4］，以明显家族聚集发病为特征，遗传性因素可能与肝癌家族聚集性发病特征有关［5］。DDX39基因是Aso-Glu-Ala-Aso（DEAD）-box解旋酶中的一员［6］，能维持染色体的完整性和调节细胞增殖、分化。研究表明DDX39基因在肿瘤细胞增殖与凋亡等方面起重要作用，与肾透明细胞癌［7］、乳腺癌［8］、恶性胸膜间皮瘤［9］、胃肠间质瘤［10］、膀胱癌［11］、胰腺癌［6］和肝癌［12］的发生发展有关，但DDX39基因rs12461754单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与肝癌高发家系遗传易感性的相关性报道较少。本研究以广西扶绥县肝癌高发家系和正常对照家系为研究对象，探讨DDX39基因rs12461754位点单核苷酸多态性与广西扶绥县肝癌高发家系遗传易感性的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取广西扶绥县20个肝癌高发家系共77例和10个正常对照家系共35名为研究对象。肝癌高发家系由2003年1月至2011年11月在广西医科大学附属肿瘤医院接受外科手术治疗的扶绥县肝癌患者20例（肝癌高发家系肝癌组）及与其有血缘关系但未患肝癌的直系亲属57例（肝癌高发家系非肝癌组）组成，肝癌患者病史采集提示至少有1名直系亲属术后经组织病理学确诊为肝癌，术前均未行放疗、化疗或生物治疗等。其中男性43例，女性34例，年龄16～86岁，中位年龄43岁；HBsAg（+）48例，HBsAg（-）29例；AFP（+）13例，AFP（-）64例；吸烟17例，不吸烟（＜10支/d）60例；饮酒11例，不饮酒（＜100 g/d）66例。正常对照家系组35名，选自与肝癌高发家系居住在同一村落的人群，且与肝癌高发家族无血缘关系，入选标准：肝功能正常、AFP阴性、HBsAg阴性、无肿瘤家族史及遗传病史。其中男性22名，女性13名，年龄16～85岁，中位年龄50岁；吸烟13名，不吸烟（＜10支/d）22名；饮酒13名，不饮酒（＜100 g/d）22名。肝癌高发家系与正常对照家系性别、年龄等差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。所有研究对象均签署知情同意书，采集晨起空腹静脉血液5 mL，血液样本按照国家人类基因组研究伦理学准则采集。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂及仪器血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）购自北京天根生物公司，组织DNA提取试剂盒购自大连宝生物工程有限公司，深圳华大基因公司合成的单碱基延伸引物、PCR扩增引物，Iplex Gold Reagent Kit试剂盒、MassARRAY Samsung Nanodispenser RS 1000纳升点样仪、MassARRAY Analyzer Compact质谱系统均购自美国Sequenom公司，质谱微阵列芯片SpectroCHIP、热启动Taq酶购自美国Agena Bioscience公司。

1.2.2 DNA提取采用组织DNA提取试剂盒提取20例肝癌高发家系肝癌组患者的组织标本DNA，采用血液DNA提取试剂盒提取57例肝癌高发家系非肝癌组及35名正常对照家系组人群的静脉血液标本DNA。用分光光度计检测以上提取的DNA纯度，OD值在1.7～2.1之间视为纯度合格。稀释纯度合格的DNA浓度至50 μg/μL左右，保存于-20℃冰箱备用。

1.3 DDX39基因型分析

1.3.1 引物设计及合成每个SNP位点需一条延伸引物和两条PCR扩增引物，采用美国Sequenom公司Assay Designer 3.1 software设计引物，由深圳华大基因公司合成上述设计的引物。

1.3.2 PCR扩增及芯片点样采用热启动Taq酶扩增目的片段（40个循环），然后加入2 μL碱性酸化酶SAP消化液（双蒸水1.53 μL，hME缓冲液0.17 μL，SAP 0.474 μL）至上述5 μL PCR产物中，以除去未用尽的dNTP，按照37℃60 min→85℃10 min→12℃长期保存的反应程序进行。然后根据Sequenom程序进行单碱基延伸。产物经树脂除盐纯化，然后采用MassARRAY Samsung Nanodispenser RS 1000纳升点样仪分点在质谱微阵列芯片SpectroCHIP上。

1.3.3 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术（matrix assisted laser desorption ionization-time of fightmass，MALDI-TOF-MS）检测SNP位点采用Sequenom Massarray平台对DDX39基因进行SNP分型。在每个SNP MALDI-TOF-MS质谱图上，有对应3个质量检测的3条线：第一条线对应未延伸引物（unextension primer，UEP），第二、三条线对应两个等位基因型；同一种颜色可以对应2个或3个峰值，分别是SNP位点的两个等位基因峰和延伸引物峰，出峰的线条代表对应的基因型，若该位点属于杂合子，则存在2个等位基因峰；若为纯合子，则仅存在1个等位基因峰［13］。

1.4 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件对数据进行统计学分析。采用拟合优度χ2检验进行Hardy-Weinberg遗传基因型分布平衡检验，判断研究对象人群的代表性；采用非条件logistic回归分析法计算不同基因型肝癌发病风险的比值比（odds ratio，OR）及95%可信区间（95%CI）。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 基因型检测结果

112例样本基因分型检测结果显示，DDX39基因rs12461754位点存在AA、AG、GG三种基因型，其中AA基因型2例、AG基因型28例、GG基因型82例。见图1。

图1 DDX39基因（rs12461754）SNP位点基因型分型图

2.2 Hardy-Weinberg遗传平衡检验

Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果显示，各组基因型频率的观察值与期望值差异无统计学意义（P＞0.05），提示DDX39基因rs12461754位点基因型频率符合遗传平衡定律，所选样本具有广西人群代表性。见表1。

表1 DDX39基因rs12461754位点基因型Hardy－Weinberg遗传平衡检验

2.3 DDX39基因rs12461754位点单核苷酸多态性与广西肝癌家系遗传易性的关系

DDX39基因rs12461754位点等位基因G与A在肝癌高发家系肝癌组人群中的分布频率分别为90%和10%，在肝癌高发家系非肝癌组人群中的分布频率分别为88.60%和11.40%，在正常对照家系组人群中的分布频率分别为78.57%和21.43%；正常对照家系组人群中携带A等位基因型的个体发生肝癌的风险是G等位基因型个体的0.407倍（95%CI：0.125～1.326，P=0.136），肝癌高发家系非肝癌组人群中携带A等位基因型的个体发生肝癌的风险是G等位基因型个体的0.981倍（95%CI：0.298～3.236，P=0.976）。肝癌高发家系肝癌组人群中GG、AG、AA基因型分布频率分别为80%、20%、0，肝癌高发家系非肝癌组人群分别为77.19%、22.81%、0，正常对照家系组人群分别为62.86%、31.43%、5.71%。肝癌高发家系非肝癌组人群中携带AG基因型的个体发生肝癌的风险是GG基因型个体的0.846倍（95%CI：0.24～2.978，P=0.795），正常对照家系组人群中携带AG基因型的个体发生肝癌的风险是GG基因型个体的0.5倍（95%CI：0.134～1.859，P=0.301）。见表2。

表2 DDX39基因rs12461754位点单核苷酸多态性与肝癌家系遗传易感性的关系［n（%）］

3 讨论

肝癌是一种多因素影响、多阶段进展和多基因变异的疾病，是我国和东南亚地区的多发病和常见病，致病因素包括HBV/HCV感染、黄曲霉毒素B1暴露、饮用水污染、肝癌家族史等。肝癌早期无明显症状，缺乏特异、敏感的诊断标志物，恶性程度高，发现时多属中晚期，预后较差。SNP是基因单个碱基转换、插入或缺失等引起的DNA序列多态性，占所有已知基因多态性的90%以上。不同的人群中SNP分布存在差异，这些差异可代表某一种族或某一人群间的遗传变异。SNP位点中所包含的遗传信息对一些恶性肿瘤的致病因子起关键作用，与某些肿瘤遗传易感性显著相关，可作为分子遗传标志，在流行病学调查中确定患某种肿瘤的高危人群及进行患病危险程度评价，为肿瘤基因治疗提供有效的靶点，促进肿瘤治疗药物的开发。因此SNP的研究对肝癌的预防、诊断和治疗具有重要意义［14］。本课题组前期采用生物信息学技术筛选出肝癌相关基因单核苷酸多态性位点作为研究靶点，发现HGF基因rs5745652位点、PLXNC1基因rs2272335位点单核苷酸多态性与肝癌家系遗传易感性有相关性，但未发现Caspase 9基因rs2309838位点和rs9282624位点、XRCC1基因rs25487位点和rs25489位点、CXCL12基因rs3780891位点、ESR1基因rs3798757位点、Itgb1基因rs2298141位点单核苷酸多态性与肝癌家系遗传易感性的相关性。

DDX39具有ATP水解和RNA解旋功能［15］。它参与细胞代谢、DNA合成以及细胞周期、细胞凋亡、癌基因表达的调控，因此肿瘤细胞生物学性质的改变常引起DDX39发生适应性改变，DDX39的表达失调可能是肿瘤发生、发展的重要因素。此外，DDX39对端粒酶有催化作用，当端粒酶被过度激活后，端粒的长度和结构稳定，从而维持基因组的完整，影响细胞正常衰老进程，使细胞永生化［16-17］。反之，沉默内源性DDX39基因后，端粒酶活性降低，端粒缩短，可加快细胞衰老进程，诱发细胞凋亡。染色体如没有端粒酶的保护，可引发DNA损伤，从而引起细胞周期阻滞。但目前尚未发现DDX39基因rs12461754位点单核苷酸多态性与肝癌遗传易感性的相关研究。本研究探讨DDX39基因rs12461754位点单核苷酸多态性与广西扶绥县肝癌家系遗传易感性的关系，结果显示，正常对照家系组人群和肝癌高发家系非肝癌组人群中携带A等位基因型的个体发生肝癌的风险是G等位基因型个体的0.407倍和0.981倍，但差异无统计学意义。正常对照家系组和肝癌高发家系非肝癌组人群中携带AG基因型的个体发生肝癌的风险是GG基因型个体的0.5倍和0.846倍，差异亦无统计学意义。提示DDX39基因rs12461754位点单核苷酸多态性与肝癌的发生无明显相关性。

综上所述，本研究尚未发现DDX39基因rs12461754位点单核苷酸多态性与肝癌家系遗传易感性有明显相关性，尚不能作为广西扶绥县人群预测个体对肝癌遗传易感性的标记。但因本研究收集的病例数及正常对照者较少，且研究局限于广西扶绥县人群，因此有一定局限性，仍需进一步扩大样本量及在不同地域、不同人群中加以研究。

［1］ Ferlay J，Soerjomataram I，Dikshit R，et al.Cancer incidence and mortality worldwide：sources，methods and major patterns in GLOBOCAN 2012［J］.Int J Cancer，2015，136（5）：E359-E386.

［2］陈万青，郑荣寿，张思维，等.2012年中国恶性肿瘤发病和死亡分析［J］.中国肿瘤，2016，25（1）：1-8.

［3］秦叔逵，樊嘉，沈锋，等.原发性肝癌诊疗规范（2011年版）［J］.临床肝胆病杂志，2011，27（11）：1141-1159.

［4］黄天壬，韦忠亮，汪凯波，等.广西扶绥县居民1997～2003年肝癌发病率分析［J］.广西医学，2006，28（9）：1336-1339.

［5］黎莎，岳惠芬，崔英，等.广西扶绥县原发性肝癌家系的调查分析［J］.中国癌症防治杂志，2015，7（3）：218-221.

［6］ Kuramitsu Y，Suenaga S，Wang Y，et al.Up-regulation of DDX39 in human pancreatic cancer cells with acquired gemcitabine resistance compared to gemcitabine-sensitive parental cells［J］.Anticancer Res，2013，33（8）：3133-3136.

［7］李凤，翁文浩，龙吟，等RNA解旋酶DDX39对肾透明细胞癌增殖的影响［J］.同济大学学报，2014，35（5）：11-15.

［8］ Calderón-González KG，Valero Rustarazo ML，Labra-Barrios ML，et al. Determination of the protein expression profiles of breast cancer cell lines by quantitative proteomics using iTRAQ labelling and tandem mass spectrometry［J］.J Proteomics，2015，124：50-78.

［9］ Kuramitsu Y，Tominaga W，Baron B，et al.Up-regulation of DDX39 in human malignant pleural mesothelioma cell lines compared to normal pleural mesothelial cells［J］.Anticancer Res，2013，33（6）：2557-2560.

［10］Kubota D，Okubo T，Saito T，et al.Validation study on pfetin and ATP-dependent RNA helicase DDX39 as prognostic biomarkers in gastrointestinal stromal tumour［J］.Jpn J Clin Oncol，2012，42（8）：730-741.

［11］Kato M，Wei M，Yamano S，et al.DDX39 acts as a suppressor of invasionforbladdercancer［J］.Cancer Sci，2012，103（7）：1363-1369.

［12］Naboulsi W，Megger DA，Bracht T，et al.Quantitative Tissue Proteomics Analysis Reveals Versican as Potential Biomarker for Early-Stage Hepatocellular Carcinoma［J］.J Proteome Res，2016，15（1）：38-47.

［13］许铭炎，邓小玲，陈锡和，等.飞行时间质谱法检测干扰素调节因子6单核苷酸多态性的研究［J］.广东牙病防治，2011，19（7）：339-342.

［14］魏瑜，高媛，程江，等.单核苷酸多态性在医学领域的应用［J］.现代生物医学进展，2010，10（5）：954-956.

［15］沈翠翠，黄培.DEAD box家族蛋白与大肠癌［J］.世界华人消化杂志，2016.24（18）：2811-2816.

［16］Yoo HH，Chung IK.Requirement of DDX39 DEADbox RNA helicase for genome integrity and telomereprotection［J］.Aging Cell，2011，10（4）：557-571.

［17］Noureini SK，Wink M.Antiproliferative ef fect of theisoquinoline alkaloid papaverine in hepatocarcinoma HepG-2 cells-inhibition of telomerase and induction ofsenesce［J］.Molecules，2014，19（8）：11846-11859.

［2016-10-09收稿］［2016-11-15修回］［编辑罗惠予］

DDX39 single-nucleotide polymorphism and genetic susceptibility to hepatocellular carcinoma in clusters of families with liver cancer in Fusui County，Guangxi

Ren Ai'hua1，2，3，Liao Yan4，Wei Liujun1，2，3，Zhao Ruiqiang5，Wei Feifei1，Xie Yu'an1（1Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University/The Guangxi Cancer Prevention and Treatment Research Institute；2National Center for International Research of Biological Targeting Diagnosis and Therapy/Guangxi Key Laboratory of Biological Targeting Diagnosis and Therapy Research/Collaborative Innovation Center for Targeting Tumor Diagnosis and Therapy/Guangxi Key Laboratory of Biological Sensor；3Graduate School of Guangxi Medical University；4The Third Affiliated Hospital of Guangxi Medical University/The Second People's Hospital of Nanning；5Department of Biochemistry and Molecular Biology of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

Xie Yu'an.E-mail：gxwskj@163.com

ObjectiveTo investigate the relationship between DDX39 rs12461754 single-nucleotide polymorphism（SNP）and family clustering genetic susceptibility to hepatocellular carcinoma（HCC）in Guangxi.MethodsGenotypes and alleles at SNP rs12461754 were determined using time-of-flight mass spectrometry in 20 HCC family groups（77 cases）and 10 normal control family groups（35 cases）in Fusui County.ResultsRisk of HCC for individuals with the A allele of DDX39 rs12461754 was 0.407-fold（95%CI：0.125-1.326，P=0.136）the risk for individuals with the G allele among normal control groups，while risk of HCC for individuals with the A allelewas 0.981-fold（95%CI：0.298-3.326，P=0.976）the risk for individuals with the G allele among unaffected members of HCC families. The frequencies of A and G alleles were similar between patients and unaffected individuals of HCC families（P＞0.05）.Frequencies of AA，AG，and GG genotypes did not differ significantly between patients in HCC families and unaffected individuals in HCC families or normal control families.ConclusionAlleles at the DDX39 SNP rs12461754 site may not correlate with family clustering of HCC in Guangxi.

Liver neoplasms；DDX39 gene；Single nucleotide polymorphism；Genetic susceptibility

R735.7

1674-5671（2016）06-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2016.06.02

国家自然科学基金资助项目（81260320）

谢裕安。E-mail：gxwskj@163.com