广西扶绥县壮族肝癌家系人群Itgb1基因多态性与肝癌遗传易感性的研究

毛赛兰 何承诚 赵瑞强 闫雷 黄正 谢裕安

原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，而肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，以下简称肝癌）占原发性肝癌的90%。在我国肝癌发病呈明显的地域分布，广西扶绥县和江苏启东县是我国肝癌高发地区。流行病学调查显示，广西扶绥县肝癌的发病率为54/10万［1］。肝癌发病的危险因素很多，其中肝癌家族史是其重要的危险因素。研究表明，扶绥县有29.4%的肝癌病例有肝癌家族史［2］。这说明肝癌的发生可能有遗传易感性。目前，对于某些特定基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与肿瘤遗传易感性的关系一直是研究热点［3～9］。研究发现，Itgb1基因的异常表达与肿瘤的发生、发展息息相关［4～6］。本研究采用病例-对照研究的方法探讨Itgb1基因rs2298141位点的SNP与肝癌遗传易感性的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究采用病例-对照研究方法，实验对象均来自长期生活在广西扶绥县的壮族人群。包括20个肝癌高发家系共79例（肝癌高发家系组）和10个正常对照家系共40名（正常对照家系组）。纳入标准：肝癌高发家系组由肝癌患者及与其有血缘关系的直系亲属共同组成。其中肝癌患者为2003年1月至2011年5月在广西医科大学附属肿瘤医院进行手术治疗的扶绥县壮族患者，术后经组织病理学诊断为肝癌，术前未行放疗、化疗或生物治疗，病史采集提示其直系亲属中至少有1人确诊为肝癌。正常对照家系组选自在当地医院进行健康体检的人群，与肝癌高发家系组成员居住在同一村庄但无血缘关系。纳入标准：肝功能正常，无肝病史，无乙型肝炎病毒感染史，AFP阴性，无肿瘤家族史及遗传病史。

肝癌高发家系组79例，其中男45例，女34例，中位年龄44岁（16～86岁）；吸烟17例，不吸烟（＜10支/d）62 例；HBsAg（+）50 例，HBsAg（-）29 例；AFP（+）14例，AFP（-）65例；饮酒 64例，不饮酒（＜100 g/d）15例。正常对照家系组40名，其中男26名，女14名，中位年龄47岁（16～85岁）；吸烟15名，不吸烟（＜10支/d）25名；饮酒17名，不饮酒（＜100 g/d）23名。两组年龄、性别等差异均无统计学意义（P＞0.05）。样本的采集过程严格遵守国家人类基因组研究伦理学准则，所有入选者均签署知情同意书。

1.2 试剂和仪器

血液、细胞、组织DNA提取试剂盒（离心柱型）购自北京天根生物科技有限公司；Iplex®Gold Reagent Kit试剂盒、MassARRAY Assay Designer 3.1软件、MassARRAY Nanodispenser RS 1000纳升点样仪、MassARRAY Analyzer Compact质谱系统 、TYPER 4.0软件均购自美国 Sequenom公司；PCR扩增引物、单碱基延伸引物购自深圳华大基因公司。

1.3 DNA提取

采用组织DNA提取试剂盒提取20例肝癌患者手术切除的癌组织标本中的DNA；采用血液DNA提取试剂盒于清晨空腹时提取肝癌高发家系组中59例非肝癌患者以及正常对照家系组40名外周静脉血中的DNA。将提取的DNA置于-20℃冰箱保存备用。实验用的DNA均经分光光度计定量，纯度合格。

1.4 Itgb1基因分型

利用SEQUENOM实验平台，以时间飞行质谱技术（MALDI-TOF MS）完成对所有研究对象DNA的SNP基因分型，以TYPER 4.0软件分析实验结果，获得分型数据。

1.4.1 PCR引物设计及合成 应用MassARRAY Assay Designer 3.1软件设计并经深圳华大基因公司合成，一个SNP位点对应2条PCR扩增引物和1条延伸引物，PCR上游引物为5′-CATGCAAGTTGCAGTTTGC-3′，下游引物为 5′-CATGCAAGTTGCAGTTTGT-3′，延伸引物为 5′-CATGCAAGTTGCAGTTTG-3′。

1.4.2 PCR扩增、引物延伸反应、产物纯化及芯片点样 使用热启动Taq酶在384孔板上常规扩增待测片段（35个循环），然后在 PCR产物中加入 2 μL碱性酸化酶（SAP）消化液（双蒸水 1.53 μL，hME缓冲液 0.17 μL，SAP 0.474 μL），进行消化反应（37℃反应60 min；85℃反应10 min），以除去未用尽 dNTP。然后应用SEQUENOM程序进行引物延伸反应和延伸产物纯化反应。利用纳升点样仪将纯化后的产物，从384孔板上转移分点在覆盖基质的质谱微阵列芯片SpectroCHIP上［10］。

1.4.3 检测SNP位点 采用SEQUENOM平台对Itgb1基因进行SNP分型，将已点好样的Spectro CHIP芯片，放入质谱仪检测，进行全自动分析。TYPER 4.0软件分析实验结果，获得分型数据。根据引物延伸反应产物质谱峰的位置确定其分子质量，从而得出基因的分型结果。同一种颜色可以对应2个或3个峰值，分别为SNP位点的延伸引物峰及其两个等位基因峰，若该位点属于纯合子，则仅存在1个等位基因峰；若为杂合子，则存在2个等位基因峰［10］。

1.5 统计学分析

采用SPSS 21.0统计学软件对实验数据进行统计分析。根据Hardy-Weinberg定律进行遗传平衡检验，采用χ2检验分析各基因型在肝癌高发家系组和正常对照家系组中的遗传吻合程度；采用非条件logistic回归法计算相对危险度（OR）和95%可信区间（95%CI）。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Itgb1基因rs2298141位点的基因型检测结果

119例标本基因分型的检测结果显示，Itgb1基因rs2298141位点存在GG、AG、AA 3种基因型，其中GG基因型19例，AG基因型49例，AA基因型51例。见图1。

2.2 Itgb1基因rs2298141位点基因型Hardy-Weinberg遗传平衡检验

根据Hardy-Weinberg遗传平衡定律，对Itgb1基因rs2298141位点进行基因型频率吻合度检测。结果Itgb1基因rs2298141位点各基因型频率与期望值吻合度较好（P＞0.05），符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，说明各组人群具有良好的代表性。见表1。

图1 Itgb1（rs2298141）基因SNP位点基因型分型图

表1 Itgb1基因rs2298141位点基因型Hardy-Weinberg遗传平衡检验［n（%）］

2.3 Itgb1基因rs2298141位点基因型与肝癌易感性的关系

正常对照家系组人群中AA、AG、GG基因型频率分别为40.00%、47.50%、12.50%。肝癌高发家系组中肝癌患者AA、AG、GG基因型频率分别为50.00%、40.00%、10.00%；肝癌高发家系组中未患肝癌者AA、AG、GG基因型频率分别为42.37%、37.29%、20.34%。正常对照家系组人群中AG、GG基因型个体罹患肝癌的风险分别是AA基因型个体的0.67倍（95%CI：0.22～2.1，P=0.50）和 1.05 倍（95%CI：0.17～6.6，P=0.96）；肝癌高发家系组中未患肝癌者AG、GG基因型个体罹患肝癌的风险分别是AA基因型个体的0.91倍（95%CI：0.31～2.71，P=0.86）、2.2 倍（95%CI：0.40～11.96，P=0.37），但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 Itgb1基因rs2298141位点基因型与肝癌易感性的关系［n（%）］

3 讨论

肝癌具有症状隐匿、特异性不明显、恶性程度高、进展快、死亡率高等特点，大多数患者发现时已为中晚期，预后较差。肿瘤的发生、发展是一个多因素、多阶段的过程，是遗传和外部因素共同作用的结果。基因作为遗传物质的载体，其SNP构成了人类基因90%以上的变异。基因的SNP主要是指在基因组水平上单个核苷酸的变异，包括置换、缺失、插入等所引起的DNA序列改变，形成遗传的多态性。SNP在肝癌发生的多个阶段中决定着肝癌发生的遗传易感性，及时筛查、鉴别肝癌相关基因的SNP，有助于对肝癌高危人群的预测［3］。

Itgb1基因所表达的蛋白称为整合素β1。整合素是由α、β两个亚基组成的异二聚体，广泛分布于人体细胞的表面，介导细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的黏附和信号传递。整合素在肿瘤发生、发展、浸润的各个阶段均发挥着重要的作用。目前研究已经证实，整合素与肿瘤新生血管有密切关系，可通过调节基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）的分泌和活化，影响肿瘤细胞与细胞外基质的黏附［11～13］。整合素表达于血管内皮细胞的有腔面和无腔面，介导内皮细胞的迁移和毛细血管管腔的形成。其中，整合素α5β1能与纤维黏合蛋白相互作用，从而增加肿瘤中的血管密度，加快肿瘤血管的生成。MMPs对细胞外基质的降解，是肿瘤细胞转移和侵袭的关键环节，整合素通过调节其分泌和活化，影响肿瘤细胞的迁移和浸润［11，13］。目前已经发现Itgb1基因的异常表达与结肠癌、子宫内膜癌、胰腺癌等的发生存在相关性［7～9］。也有实验证明整合素在肝癌细胞侵袭和转移过程中发挥重要作用［12］。有研究表明，整合素拮抗剂可通过影响肿瘤细胞和肿瘤相关宿主细胞抑制肿瘤的生长［14］。研究整合素基因的SNP与肝癌的相关性，不仅有助于定位与疾病相关的遗传位点，也对肝癌的早期预测、易感人群的筛查和新治疗药物的研发具有重要的意义。目前对于Itgb1基因多态性与肿瘤相关性的研究较多，但涉及肝癌较少。因此本研究对广西扶绥县壮族人群Itgb1基因rs2298141位点进行研究，结果表明，正常对照家系组人群中AG、GG基因型个体发生肝癌的风险分别是AA基因型个体的0.67倍 （95%CI：0.22～2.1，P=0.50）和1.05 倍（95%CI：0.17～6.6，P=0.96）；肝癌高发家系组中未患肝癌者AG、GG基因型个体发生肝癌的风险分别是AA基因型个体的0.91倍（95%CI：0.31～2.71，P=0.86）和 2.2 倍（95%CI:0.40～11.96，P=0.37）。携带纯合子突变GG基因型个体患病风险增加，但差异无统计学意义（P＞0.05）。提示在广西扶绥县壮族人群中，Itgb1基因rs2298141位点的SNP与广西肝癌高发家系肝癌遗传易感性不相关。

本研究未发现Itgb1基因rs2298141位点与肝癌遗传易感性有关，原因可能为目前所收集的样本例数偏少，使结果和预期实验目标产生一定偏倚。但研究结果可为研究广西扶绥县肝癌高危人群发病风险提供分子遗传学依据，并对肝癌的预防有一定的参考价值。本研究仅以广西扶绥县壮族肝癌家系人群为研究对象，然而不同民族人群同一位点的SNP分布频率差异较大，因此Itgb1基因rs2298141位点SNP与肝癌的相关性仍需在不同地区、不同民族人群中进行探讨。

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