miR-204对乳腺癌MCF-7细胞增殖及凋亡的影响

沈思乔 肖晓玲 朱晓菲 冯振博

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，也是女性癌症死亡的主要疾病之一［1］。尽管近年来诊断技术不断发展，但乳腺癌的发病率与死亡率依然较高［2］，且有年轻化趋势［3］。由于遗传和环境因素的影响，乳腺癌的发病机制较复杂。miRNAs是一类由18～24nt组成的短链非编码RNA，转录后可对下游靶基因进行调控［4，5］。研究表明miRNAs在抑制乳腺癌细胞凋亡和促进细胞分裂方面发挥重要作用［6］。例如，miR-155、miR-221/miR-222、miR-373和miR-520c在乳腺癌中呈高表达，被认为是促癌基因［7～9］；miR-34、miR-200c和miR-205在乳腺癌中呈低表达，被认为是抑癌基因［10～13］。miR-204 作为 miRNAs中的一员，在乳腺癌组织中呈低表达［14］，但有关其生物学功能的报道仍较少。本研究对癌症和肿瘤基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）数据库中浸润性乳腺癌的miR-204相关数据进行汇总分析，并采用慢病毒技术转染人乳腺癌MCF-7细胞株，通过MTT法及流式细胞仪检测miR-204的增殖和凋亡能力，为进一步研究miR-204在乳腺癌中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

使用TCGA数据库（http：//cancergenome.nih.gov/）获取浸润性乳腺癌的相关实验及临床数据。人乳腺癌MCF-7细胞株购自中国科学院上海细胞库；DMEM（高糖）培养液、胰蛋白酶及胎牛血清均购自南京Wisent公司；青链霉素购自北京索莱宝公司；RNA提取试剂盒购自美国Axgyen公司；cDNA逆转录试剂盒、miRNA检测试剂盒(SYBR Green）、荧光定量PCR引物均购自北京天根生化科技有限公司；RNase-Free Water购自上海碧云天公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、嘌呤霉素均购自美国Sigma公司；PE An-nexin V/7AAD凋亡试剂盒、流式细胞仪均购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 TCGA数据提取及分析 在TCGA旗下的子数据库 cBioPortal（http：//www.cbioportal.org/）中选取浸润性乳腺癌1105例标本进行整理汇总，并分析其相关临床参数。

1.2.2 细胞培养 人乳腺癌MCF-7细胞株培养于10%胎牛血清的DMEM培养基中，内含1%青链霉素，置于含5%CO2、37℃恒温孵育箱中培养，每天予换液处理。

1.2.3 细胞转染 转染所用的病毒购自上海吉凯公司，取对数生长期的乳腺癌MCF-7细胞接种于6孔板中，浓度为1×105个/孔，次日融合度达30%～40%时开始转染，按照吉凯基因病毒转染操作说明书将miR-204过表达病毒及阴性对照病毒转染至乳腺癌MCF-7细胞。按照转染病毒的不同，将实验分为3组：转染miR-204过表达病毒的实验组（LV-hsa-miR-204组）、转染阴性病毒的阴性对照组（NC组）以及空白对照组（control组），转染后用含 1 μg/mL浓度嘌呤霉素的培养液进行稳定转染细胞株的筛选，并进行后续实验。

1.2.4 RNA提取及实时荧光定量PCR（RT-qPCR）按照RNA提取试剂盒的操作手册对各组细胞进行总RNA 提取，用核酸检测仪 NanoDrop 2000（Thermo，美国）对总RNA 浓度进行质控，使 1.8＜OD260/280＜2.0。将RNA逆转录成cDNA后，按照miRNA检测试剂盒（SYBR Green）说明手册配制反应体系，并上机进行检测分析。内参U6及miR-204的引物均购自北京天根生化科技有公司，序列未知。目的基因的相对表达量用 2-△△Ct方法计算。

1.2.5 MTT法检测细胞增殖活性 将筛选出的稳定转染的3组细胞（LV-hsa-miR-204组、NC组、control组）于对数生长期时接种于96孔板中，密度为3000个/孔，每组设置5个复孔，四周的空孔用PBS填充，每隔24 h检测1次，连续检测至96 h。每次每孔加入20 μL MTT溶液，放入孵育箱中培养4 h后，弃掉培养液，每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min充分反应后，酶标仪检测570 nm处吸光度值，并绘制细胞生长曲线。实验重复3次。

1.2.6 PE Annexin V/7AAD法（流式细胞仪法）检测细胞凋亡 将3组细胞培养72 h后，用不含EDTA的胰蛋白酶分别消化细胞，并用冷PBS液洗涤2次后收集细胞，用 100 μL 1×Binding Buffer重悬细胞并转移至流式检测管内，每管分别加入5 μL PE Annexin V和5 μL 7AAD，室温避光反应15 min后，再加入400 μL 1×Binding Buffer，于1 h内上机进行检测。UR为早期凋亡，LR为晚期凋亡，凋亡率=早期凋亡+晚期凋亡。每组设置3复孔，实验重复3次。

1.3 统计学处理

用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示。两组间比较用独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析，临床病理特征与miR-204表达的关系用χ2检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-204在浸润性乳腺癌组织和癌旁组织中的表达

TCGA数据库中筛选具有完整临床资料的配对病例共808例，根据数据库中检测结果汇总后发现，miR-204在浸润性乳腺癌组织中的表达明显低于相应癌旁组织，差异具有统计学意义（P＜0.001）。见图1。

图1 miR-204 mRNA在浸润性乳腺癌组织和癌旁组织中的表达

2.2 miR-204的表达与临床病理特征的关系

将808例浸润性乳腺癌患者按照年龄、性别、组织学分级、肿瘤浸润深度、是否淋巴结转移、是否远处转移进行分组。结果显示，miR-204低表达与淋巴结转移（P=0.026）和远处转移（P＜0.001）相关，与患者年龄、性别等无关（P＞0.05）。见表 1。

表1 浸润性乳腺癌组织中miR-204表达与临床病理特征的关系（n）

（续表）

2.3 慢病毒转染效率的验证

miR-204过表达病毒转染乳腺癌MCF-7细胞后，筛选稳定转染细胞株，并用RT-qPCR对3组细胞的mRNA表达情况进行检测。结果显示，转染miR-204过表达病毒的LV-hsa-miR-204组miR-204的表达量明显高于NC组及control组，差异有统计学意义（P＜0.001），提示成功构建过表达miR-204的乳腺癌MCF-7细胞株。见图2。

图2 miR-204 mRNA的相对表达量

2.4 miR-204对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

3组细胞生长至 48 h时无明显差异（P＞0.05），72 h开始 LV-hsa-miR-204组细胞增殖受到抑制，96 h细胞达到最大抑制，呈时间依赖性，与NC组和control组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图3 miR-204对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

2.5 miR-204对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测结果显示，至72 h时，LV-hsamiR-204组细胞凋亡率达（34.7±1.9）%，较NC组的（6±0.7）%和 control组的（4.3±1.3）%明显增加，差异有统计学意义（P＜0.001），说明过表达miR-204可增强细胞凋亡能力。见图4。

图4 miR-204对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响

3 讨论

大量研究表明miRNAs在增殖、凋亡、侵袭及转移等生物过程中呈现失调状态，可影响肿瘤的发生、发展。Iorio等［6］通过整合分析其结构特点及功能研究发现，miRNAs在乳腺癌中发挥重要作用。miR-204已先后在不同肿瘤组织中发现表达低于正常组织，如非小细胞肺癌［15］、胃癌［16］、甲状腺癌［17］等。Li等［14］在39例乳腺癌组织标本中发现miR-204的表达量较癌旁组织低，并且低表达的miR-204与Ⅲ～Ⅳ期、远处转移及不良预后相关。鉴于Li等［14］样本量较少且来源地区较为局限，以及miR-204发生发展的潜在分子机制尚不清楚，因此本研究首先通过TCGA数据库收集大样本病例对其进行分析，并且采用细胞转染技术对乳腺癌细胞株的生物学功能进行检测。

TCGA数据库分析结果显示miR-204在浸润性乳腺癌组织中呈现低表达状态，临床参数分析结果显示，miR-204低表达主要与淋巴结转移及远处转移相关。由此可知，miR-204与乳腺癌的发生、发展有密切联系。为了进一步证实这种联系，本研究通过对乳腺癌MCF-7细胞转染miR-204过表达病毒，行MTT法验证，结果提示过表达miR-204能够抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖。

在肿瘤形成过程中，凋亡信号通路上的蛋白常表达异常，进而使肿瘤细胞的生长得不到控制。而miR-204对于细胞凋亡的影响却不明确，为此本研究分析了miR-204与细胞凋亡的关系，结果显示过表达miR-204后，细胞凋亡能力明显增强，尤其是介导了早期凋亡，说明其有效启动了凋亡程序。Wang等［18］发现miR-204通过靶向JAK2促进STAT3/bcl-2/survivin通路对肿瘤细胞进行调节，这与本研究的结论相呼应。

化疗作为乳腺癌术后综合性治疗手段之一，在乳腺癌治疗中占据重要地位，由于乳腺癌的特殊性，其化疗药物的使用很大程度上依赖于不同激素水平的改变，例如雌激素受体（ER）的表达［19］。有趣的是，ER正是miR-204的靶蛋白。Liu等［20］通过一系列实验发现，miR-204通过结合作用于ERα对AKT/mTOR通路进行调控，miR-204低表达时ERα呈高表达状态。他莫昔芬（Tamoxifen，TAM）作为ERα特效药，对ER阳性患者具有良好作用，ERα高表达时可以通过TAM抑制雌激素刺激，同样高表达的miR-204可以降低TAM的刺激。因此，miR-204不仅与乳腺癌的发生发展有着密切联系，对于乳腺癌的治疗也发挥重要作用。

由于miRNAs需通过靶向结合互补蛋白后，才能对下游功能进行调控，上述的bcl-2及ER不是其唯一的靶蛋白，通过不同数据库检索可知，一个miRNA可以靶向成百上千个蛋白，一个蛋白也往往结合数个miRNAs，而功能相近的miRNAs和蛋白形成了巨大的相互作用网，影响不同的信号通路，而不同的通路之间又可以相互影响，进而调控肿瘤的发生发展，因此miR-204对乳腺癌发生、发展的作用机制有待更进一步深入研究。

综上所述，本研究发现miR-204在乳腺癌中低表达，并且可能参与了乳腺癌的发生、发展。过表达miR-204可抑制乳腺癌细胞增殖，促进细胞凋亡，可作为抑癌基因发挥作用。这一结果为乳腺癌的治疗提供了新的靶点及思路，并为进一步研究其分子机制提供了一定参考。

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