干扰PRMT5表达肝癌细胞稳转细胞株的建立及鉴定

季云， 李小琴， 赵婷玲， 孙庆梅， 严凌花， 李莉

临床与基础研究

干扰PRMT5表达肝癌细胞稳转细胞株的建立及鉴定

季云， 李小琴， 赵婷玲， 孙庆梅， 严凌花， 李莉

目的探讨干扰蛋白质精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)表达肝癌细胞稳转细胞株的建立及鉴定。方法针对PRMT5设计出该基因的有效短发夹RNA(shRNA)片段，选择合适慢病毒载体，通过基因工程技术，构建出PRMT5慢病毒载体介导的shRNA重组载体，并通过PCR以及测序检测构建序列的正确性。将重组病毒载体在病毒包装细胞中大量生产后，用病毒原液感染PRMT5表达量相对较高的SMMC-7721、BEL-7402细胞，2 d后，用最低杀死浓度的嘌呤霉素进行筛选，得到克隆样生长的细胞，扩大培养后分别提取蛋白和RNA，Western 印迹和qPCR检测PRMT5的表达。结果成功构建出由人源性PRMT5慢病毒载体介导的shRNA重组载体pLKO.1-sh-PRMT5，PCR及测序均证明构建序列的正确。Western 印迹法和qPCR检测，pLKO.1-sh-PRMT5干扰组的PRMT5蛋白及mRNA水平明显低于pLKO.1-sh-GFP组(P<0.05)，pLKO.1-sh-PRMT5载体具有良好的干扰效果。结论运用慢病毒感染并筛选出稳转细胞株，在干扰效率及经济角度均优越于瞬时转染，为今后研究PRMT5在肝癌细胞中作用功能提供了良好的科研工具。

蛋白质精氨酸N-甲基转移酶； RNA； 小分子干扰； 慢病毒属； 载体蛋白质类； 蛋白质精氨酸甲基转移酶5

蛋白质精氨酸甲基转移酶5(protein arginine methyltransferase 5，PRMT5)属于蛋白质精氨酸甲基转移酶(protein arginine methyltransferases，PRMTs)家族，它能将S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到底物蛋白质中精氨酸的胍基上[1]。与其他的PRMTs家族成员不同，PRMT5能作用于细胞内不同的蛋白质，包括ATP依赖的染色质重塑和共抑制因子诱导的基因沉默。近年来，研究发现，PRMT5参与细胞水平的生物学调控，如核糖体的合成[2]，高尔基体的组装[3]，细胞的分化[4-6]和生殖细胞的分化[7-8]。越来越多的研究表明，PRMT5与肿瘤的发生发展有关，PRMT5参与调控一些主要的信号转导通路，继而影响细胞死亡和恶性转化[9]。本研究构建PRMT5 短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)慢病毒载体，靶向沉默PRMT5基因的水平，包装慢病毒，感染肝癌细胞，筛选稳转细胞株， 并应用Western 印迹和qPCR分别检测稳转细胞中PRMT5基因蛋白和mRNA水平，验证其干扰效率。

1 材料与方法

1.1 细胞复苏

细胞复苏、传代，含10%FBS的DMEM培养基预热至37 ℃左右，置于细胞培养箱中孵育(37 ℃、5%CO2)。

1.2 重组慢病毒载体构建

据Sigma官网提供的shRNA序列，设计对照组GFP shRNA干扰序列的引物。

sh-GFP:正向:5-CCGGGCAAGCTGACCCTGAAGT-TCATCTCGAGATGAACTTCAGGGTCACGTTGCTTTTTG-3;反向:5-AATTCAAAAAGCAAGCTGACCCTGAAGT-TCATCTCG-AGATGAACTCAGGGTCACGTTGC-3。

据Sigma官网提供的shRNA序列，选择干扰效率达95%的PRMT5 shRNA干扰序列(此序列干扰PRMT5的3’非编码端)。sh-PRMT5：正向5’-CCGGGGCTCAAGCCACCAATCTATGCTCGAGCATA GATTGGTGGCTTGAGCCTTTTTG-3’;反向5’-AATTCAAAAAGGCTCAAGCCACCAATCTATGCTCGAGC ATAGATTGGTGGCTTGAGCC-3。shRNA oligos退火，慢病毒骨架质粒pLKO.1-TRC双酶切和胶回收。连接、转化和菌液PCR鉴定，转化连接反应产物时，设立对照组(即双酶切后的连接产物)，挑多个单克隆菌落于含有1 ml含Amp的LB的微量离心管内，37 ℃，220 r/min细菌摇床上摇3～4 h，进行细菌扩增，以得到的菌液为模板，进行菌液PCR鉴定。

上述反应体系中引物序列：正向5’-GCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGA-3’;反向5’-TGCCATTTGTCTCGAGGTCG-3。

测序鉴定：将质粒邮寄至南京金斯瑞公司进行测序，其测序引物为GGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGA。

1.3 包装病毒

实验前1天将293T传代接种于6孔板内，接种密度以第2天汇合度达50%～70%为宜。转染前给细胞换液(改为不含FBS的 DMEM)，使其饥饿2 h，以提高效率，以6孔板中的1个孔为例，细胞接种1×106个。

pLKO.1-sh-EGFP/pLKO.1-sh-PRMT5质粒1μgpsPAX2包装质粒0.75μgpMD2.G穿梭质粒0.25μgLipofectamineTM2000/PEI4～6μl无血清培养基100μl

包装上病毒的293T细胞生长缓慢，且形态变圆，培养基颜色变黄，48 h后吸取培养基于新的微量离心管，4 ℃，4 000 r/min离心10 min，去除细胞碎片等沉淀，所得的上清液即为病毒上清液，分装于微量离心管内，-80 ℃冰箱保存。

1.4 感染细胞

取对数生长期的SMMC-7721和BEL-7402分别接种6孔板的两个孔，细胞密度为3×106个/每孔。加病毒原液前换液，使用含聚凝胺的培养基，再分别加入200 μl pLKO.1-sh-PRMT5或pLKO.1-sh-GFP慢病毒原液(聚凝胺的最终浓度为8 μg/ml)，24 h后同样的方法追加病毒1次。48 h后将培养基换为含嘌呤霉素的培养基进行筛选(设立对照，即未感染病毒的SMMC-7721和BEL-7402)，使用浓度为最低杀死浓度，直至未感染病毒的对照组细胞完全被杀死。而实验组细胞连续培养几代后可见克隆样细胞生长，此时改用低浓度的嘌呤霉素培养基维持培养。所得到的细胞株分别为抑制GFP水平的稳转细胞株sh-GFP以及抑制PRMT5水平的稳转细胞株sh-PRMT5。

1.5 总RNA提取

用PBS清洗细胞1～2次，加入1 ml Trizol 裂解细胞10 min，混匀，按照试剂盒操作步骤提取总RNA，核酸蛋白仪测定RNA含量及纯度，-80 ℃冰箱保存。

1.6 反转录和qPCR检测方法

1.6.1 反转录 从-80 ℃冰箱取出提取的RNA，冰上融化，根据Thermo反转录反应试剂盒说明书进行。1.6.2 实时PCR mRNA PCR引物如下。GAPDH：正向5’-ACCATCTTCCAGGAGCGAGAT-3’，反向5’-ATGACGAACATGGGGGCATC-3’；PRMT5：正向5’-GGACGGAGAAGGGCAGACTA-3’，反向5’-CCCGCATCCAGAACATGGAA-3’。

计算结果用2-ΔΔCt表示，ΔCt=Ct(sh-PRMT5)-Ct(GAPDH)，ΔΔCt=ΔCt(sh-PRMT5)-ΔCt(sh-EGFP)。

1.7 Western印迹检测方法

1.7.1 蛋白质提取 冰上操作：弃培养基，用预冷的PBS缓冲液洗1～2次，加入蛋白裂解液，刮下细胞于微量离心管中，冰上裂解30 min。在超声波细胞破碎仪下超声裂解细胞碎片，4 ℃，12 000 r/min离心10 min，吸取上清置新的微量离心管，置于冰箱-80 ℃保存备用。

1.7.2 免疫印迹 配胶、上样、电泳、转膜，用5%脱脂牛奶封闭液或5%BSA封闭液室温封闭1～2 h，一抗孵育，4 ℃孵育过夜。漂洗，TBST漂洗3次，每次10 min。二抗孵育，放入稀释的二抗(1∶5 000)。室温下，摇床晃动2 h。洗净二抗后，用滤纸吸干膜上的液体，将ECL发光液滴入膜上，确保膜各部分受液均匀，在电子凝胶成像系统下，显影、拍照。

2 结果

2.1 pLKO.1-TRC质粒双酶切

选取AgeI和EcoRI进行载体双酶切，将产物行琼脂糖电泳鉴定。结果显示：泳道1是15 000 bpDNA标准参照物；泳道2为pLKO.1-TRC空载质粒；泳道3为pLKO.1-TRC空载质粒双酶切成线性的片段。载体被切下了1 500 pb小片段，说明质粒pLKO.1-TRC双酶切成功(图2A)。

2.2 菌液PCR鉴定重组质粒pLKO.1-sh-PRMT5

PRMT5 shRNA oligos退火后与pLKO.1-TRC双酶切后的产物连接后，转入Stbl3后转化。挑阳性单克隆加入至LB中扩增3～4 h，行菌液PCR鉴定。根据所设计的引物，阳性克隆菌液PCR可获得257bp DNA片段(图2B)，泳道2至泳道7无杂带，且条带位置正确，提示所构建的重组质粒pLKO.1-sh-PRMT5连接成功。

图2 载体构建

2.3 pLKO.1-sh-PRMT5质粒测序结果

经菌液PCR鉴定为阳性克隆，进行质粒扩增后，抽提质粒送至南京金斯瑞公司测序，测序引物为：GGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGA。测序结果显示(图3A、图3B)，标有下划线部分的序列与本实验设计的PRMT5 shRNA oligo前链完全一致，并附此部分序列的测序峰值图，由此说明，所构建pLKO.1-sh-PRMT5质粒正确。

图3A pLKO.1-sh-PRMT5质粒测序结果

图3B pLKO.1-sh-PRMT5质粒测序峰值图

2.4 检测pLKO.1-sh-PRMT5干扰效率

慢病毒包装后，镜下细胞变圆变亮，且培养液由红转黄。用病毒原液感染PRMT5表达量相对较高的SMMC-7721、BEL-7402细胞2 d后，用最低杀死浓度的嘌呤霉素进行筛选，得到克隆样生长的细胞，扩大培养后分别提取蛋白和RNA，Western 印迹和qPCR检测PRMT5的表达。结果表明，pLKO.1-sh-PRMT5干扰组的PRMT5蛋白及mRNA水平明显低于pLKO.1-sh-GFP组(P<0.05)(图4)。提示pLKO.1-sh-PRMT5载体具有良好的干扰效果。

图4 shRNA沉默肝癌细胞株PRMT5基因的验证结果

3 讨论

RNAi干扰是近年来日渐成熟的基因沉默技术，在1998年由Fire等首次提出[10]，它是由双链RNA介导、Dicer酶参与的，能特异、高效地沉默靶向基因[11]。此项干扰技术在探索生物基因功能、人类传染性疾病、免疫疾病及肿瘤发生机制和治疗等领域应用广泛。

RNAi干扰技术是将21～23个与目的基因同源的外源性核苷酸片段转染至生物体内，在细胞内与dsd RNA特异性的RNAase Ⅲ endonuclease酶结合并诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex，RISC)的形成，RISC以dsd RNA为模板特异地识别外源性基因表达的同源基因mRNA，并在结合部位对其进行剪切，导致被剪切的靶序列mRNA降解，从而抑制该基因的表达。RNAi技术能高效特异的阻断基因的表达，使靶基因功能丧失或降低基因突变这一特性，使该技术被广泛地应用到研究基因功能及肿瘤的基因治疗领域。

RNAi在实际应用中仍存在许多技术难题：①因病毒的核酸复制缺乏严格的碱基修复系统，易出现碱基突变，影响干扰效果；②在高度折叠或二级结构中，隐藏在其中某些RNAi序列不被Dicer酶识别及切割，因此在科研中，常需选择多个RNAi序列进行验证，才能寻找到理想的siRNA识别部位[12]；③siRNA转染效率低是科研技术上的难题[13]，但近年来基因技术日益成熟，转染效率有所突破；④siRNA转染效率低、时效性短(48 h后即开始降解)、稳定性差。近年来，科研研究者们已成功的设计出一种shRNAi技术[11-12]，且该技术目前已较为成熟。在此基础上，借助慢病毒载体，通过病毒干扰生物体提高了转染效率及稳定性，可长期的稳定的表达，从经济角度考虑，shRNA更占优势[14]。因此，我们采用慢病毒载体与短发夹RNA技术，克服传统siRNA弊端，在干扰效率及经济角度考虑均优越于瞬时转染，为今后研究PRMT5在肝癌细胞中作用功能提供了良好的科研工具。

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EstablishmentandidentificationofPRMT5transfectedhepatocellularcarcinomacellline

JIYun,LIXiaoqin,ZHAOTingling,SUNQingmei,YANLinghua,LILi.

(DepartmentofChemotherapy,CancerCenter,AffiliatedHospitalofJiangsuUniversity,Zhenjiang212001,China)

JIYun,Email:jy751121@163.com

ObjectiveTo investigate the establishment and identification of a stable cell line expressing protein arginine methyltransferase 5(PRMT5) interference in hepatocellular carcinoma cells.MethodsThe effective short hairpin RNA(shRNA) fragment of the PRMT5 gene was designed, By selecting the suitable lentiviral vector, the recombinant vector of PRMT5 lentiviral vector mediated by shRNA was constructed by gene engineering technology. The correctness of the sequence was detected by PCR and sequencing. Recombinant viral vectors were produced in a large number in viral packaging cells. SMMC-7721 and BEL-7402 cells with high expression of PRMT5 were infected with virus solution for 2 d. The cells presented with clone-like growth were cloned by using the minimum kill concentration of puromycin. The expression of PRMT5 was detected by Western blotting and qPCR after extracting the protein and RNA.ResultsShRNA recombinant vector pLKO.1-sh-PRMT5 was successfully constructed by human derived PRMT5 lentiviral vector, and the sequence of PCR was proved to be correct. Western blotting and qPCR detection showed that the expressions of PRMT5 and mRNA in the pLKO.1-sh-PRMT5 interference group were significantly lower than those of the pLKO.1-sh-GFP group(P< 0.05). pLKO.1-sh-PRMT5 vector had good interference effect of PRMT5 protein.ConclusionsThe lentiviral vector which used to screen the stable cell line, was superior to the transient transfection in the interference efficiency and economic point of view, which provided a good research tool for studying the function of PRMT5 in hepatoma cells in the future.

Protein-arginine N-methyltransferases; RNA; Small interfering; Lentivirus; Carrier proteins; Protein arginine methyltranserase 5

212001 江苏 镇江，江苏大学附属医院 肿瘤治疗中心 化疗科

季云，Email：jy751121@163.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2017.03.014

1674-4136(2017)03-0186-05

2016-09-02][本文编辑：李庆]