癌基因c-Src抑制剂对三阴性乳腺癌的疗效评价

周士波，姚宇锋

在乳腺癌的治疗中，抗雌激素与抗HER2是两大有效的辅助靶向治疗[1-2]。对雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及HER2都不表达的乳腺癌定义为三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC),其具有很高的转移与复发率[3]。由于缺少靶向治疗的位点，传统的抗雌激素与抗HER2治疗对TNBC没有很好的治疗效果，目前临床主要采用手术与化疗。由于癌基因c-Src能介导细胞的信号传导通路，因此，有很多研究关注其在肿瘤发生、发展中的作用[4]。本文在细胞的水平上探讨c-Src抑制剂对三阴性乳腺癌的治疗效果，并与传统的靶向治疗作比较。

1 资料与方法

1.1 细胞株及细胞培养 乳腺癌细胞T47D、MDA-MB-231、Sk-Br-3购自中科院上海细胞所。T47D用RPMI 1640 培养基培养，MDA-MB-231与Sk-Br-3用DMEM 培养基培养, 并在培养基中加入10%的胎牛血清。

1.2 抗体及抑制剂 ER、PR、HER2、c-Src抗体及HER2抑制剂 Lapatinib购自Santa Cruz Biotechnology公司, c-Src磷酸化抗体购自Cell Signaling Technology公司，c-Src抑制剂PP2 购自Sigma公司。

1.3 MTT法检测细胞生长 细胞经胰酶消化后，分别上样在96孔细胞培养板，每孔接种1 000个细胞，每组三复孔。第2天开始用抑制剂治疗，并设对照组。每隔2天换1次培养液，并加入新鲜的抑制剂。治疗满5天，每孔加入10 μl MTT(5 mg/ml)试剂，将细胞放入37 ℃，5%CO2的培养箱中培养4h，可见紫色颗粒形成。每孔加入100 μl的DMSO，然后在570 nm的分光光度仪上检测OD值。细胞抑制率=OD治疗组/OD对照组×100%。

1.4 免疫电泳 上述三株细胞分别上样在10 cm细胞培皿，第2天开始用抑制剂治疗细胞，并设对照组。治疗24 h后，用细胞裂解液收集细胞。离心后，收集细胞上清液用于实验并检测蛋白浓度。免疫电泳每孔上样50 μg总蛋白。电泳结束后，用特定的第一抗体去检测目标蛋白，对应的总蛋白或β-actin作为内参照。

1.5 细胞周期 三株细胞分别上样在6孔细胞培板，每组三复孔。第2天开始用抑制剂治疗细胞，并设三复孔对照组。24 h后收集细胞，并用酒精逐渐固定细胞，最终酒精浓度为75%。在冰上放置20 min后，用PI 染色，流式细胞仪分析细胞周期。

1.6 统计学分析 采用统计软件SPSS 15.0进行数据处理。两组数值之间的差异用t检验,P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 三株细胞基本受体的表达及c-Src磷酸化水平 通过免疫电泳的方法，我们首先检测三株细胞的受体表达水平：T47D是ER和PR阳性细胞，Sk-Br-3不表达ER和PR，但有很高的HER2表达，MDA-MB-231是三阴性乳腺癌细胞，ER、PR、HER2均阴性 (图1)。三株细胞都有不同程度的c-Src磷酸化表达，相对于另外两株细胞，Sk-Br-3的c-Src磷酸化水平较低(图2)。

图1 三株细胞的受体表达水平

图2 三株细胞c-Src的表达

2.2 c-Src抑制剂对三株细胞的治疗作用 c-Src抑制剂的抗肿瘤机理是阻断其磷酸化水平。在三株细胞上，c-Src抑制剂PP2(5 μM)可以有效地抑制其酪氨酸激酶的磷酸化水平(图3)。但是，在细胞的生长上有不同的效果。PP2(5 μM)可以抑制20%T47D细胞生长，抑制80%～90%的MDA-MB-231细胞生长，对Sk-Br-3细胞没有治疗作用(图4)。

2.3 c-Src抑制剂对信号通路的抑制作用 MAPK和Akt是两条最基本的细胞生长信号通路[5]，在不同的细胞中，c-Src介导细胞生长通路的功能会有所不同。在T47D细胞上，PP2 可以抑制两条信号通路(图5A)。同样，在MDA-MB-231细胞上，PP2也很明显地抑制细胞生长通路(图5B)。而在Sk-Br-3细胞上，同样剂量的PP2 不能抑制MAPK和 Akt的磷酸化(图5C)。

图3 c-Src抑制剂对三株细胞磷酸化水平的抑制

图4 c-Src抑制剂对三株细胞生长的抑制

图5 A：c-Src抑制剂对T47D细胞生长通路的抑制；B：c-Src抑制剂对MDA-MB-231细胞生长通路的抑制；C：c-Src抑制剂对Sk-Br-3细胞生长通路的抑制。

2.4 HER2抑制剂不能阻断三阴性细胞的生长 我们进一步研究HER2抑制剂对MDA-MB-231细胞的抑制作用，并与Sk-Br-3细胞作比较。HER2抑制剂Lapatinib(1 μM) 可以明显抑制Sk-Br-3细胞的生长，而对MDA-MB-231没有效果(图6A)。在Sk-Br-3细胞上，HER2抑制剂有效地抑制了细胞生长通路MAPK和 Akt的磷酸化(图6B)。在细胞周期的改变上，HER2抑制剂可以降低Sk-Br-3细胞的S期比例，而PP2明显降低MDA-MB-231细胞的S期比例(图6C)，此结果与细胞生长反应是一致的(图4, 图6A)。

3 讨论

癌基因c-Src在人类多种肿瘤细胞上高表达或是有很高的磷酸化水平[4]，其可以介导细胞内蛋白与蛋白之间的相互反应，并参与细胞生长信号通路的传递[4-5]。在ER阳性的乳腺癌上，内分泌治疗可以提高c-Src的磷酸化水平并且促进耐药性的产生[6]。因此，c-Src抑制剂与抗雌激素治疗联合使用，可以延长耐药性产生的时间并且提高治疗效果[7-8]。目前, c-Src抑制剂已经被用于乳腺癌的临床验证阶段[9-10]，但是，对具体哪一型乳腺癌的治疗更为恰当，目前还没有明确的报告。c-Src抑制剂作用机理是阻断c-Src磷酸化及其下游的信号传导通路[5]。有报道提示肿瘤细胞不表达或低表达c-Src磷酸化，c-Src抑制剂对该类肿瘤没有很好的治疗效果[11]。本研究中T47D 与MDA-MB-231细胞有比较高的c-Src磷酸化水平(图2)，因此，细胞生长可以被c-Src抑制剂阻滞。但是，这并不意味着c-Src抑制剂对所有c-Src磷酸化阳性的细胞都有相同的疗效(图4)。c-Src抑制剂对MDA-MB-231细胞的抑制作用比对T47D强，尽管它们的c-Src磷酸化水平相似(图2)。最终的抑制效果还有赖于c-Src在特定细胞中的功能，是否介导该类型细胞的主要生长通路。并且，ER的高表达会影响c-Src抑制剂的疗效[12-13]，因为它们之间形成复杂的信号网络而相互影响。

图6 A：HER2抑制剂对MDA-MB-231与Sk-Br-3的生长抑制；B：HER2抑制剂对生长通路的抑制；C：HER2与c-Src抑制剂对细胞周期的影响

最近有研究发现，HER2阳性的乳腺癌，不适宜用c-Src抑制剂治疗[12-13]，这与我们的研究结果一致(图4)。在这类乳腺癌细胞上，HER2是主要的生长决定因素，并不依赖c-Src来传导生长信号通路，因此，抑制c-Src并不能完全抑制细胞的生长。而在三阴性乳腺癌中，由于缺乏激素受体和HER2的表达，c-Src可能是癌细胞的主要生长动力，因此抑制c-Src之后，可以明显地抑制细胞生长(图4)。

由于三阴性乳腺癌的临床预后比较差，目前还没有比较好的靶向治疗。本研究提供了一些初步的理论依据，但还需要更深入地研究具体的机制，为三阴性乳腺癌提供更好的临床治疗效果。

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