5-氮杂-2'-脱氧胞苷与顺铂对MDA-MB-231细胞的联合作用

沈三弟， 陈卓荣， 肖高芳， 刘彦明

人三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是一类雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(Her-2)均为阴性的乳腺癌，局部复发及远处转移发生率高，愈后较差［1］。手术及全身化疗是主要治疗手段，缺乏有效的内分泌及靶向治疗。DAC是一种DNA甲基转移酶抑制剂，通过使基因启动子去甲基化而激活相应的基因表达，不影响碱基序列，属于表观遗传学药物，于2004年经FDA批准用于骨髓增生异常综合征(MDS)的治疗，但用于对实体肿瘤的治疗仍在试验中［2］。本研究从表观遗传学联合遗传学角度探讨TNBC的治疗方案。

1 材料与方法

1.1 材料 人乳腺癌MDA-MB-231细胞株购自中国科学院上海细胞库，L-15培养基及胎牛血清购自Hyclone，5-Aza-CdR、PDD 购自 Sigma Aldrich。MTT购自美国USB公司，AnnexinV-FITC/PI试剂盒购自美国Beckman-Coulter公司;680型酶标仪购自美国BIO-RAD公司，流式细胞仪购于BD公司。

1.2 实验分组 实验分为5组，DAC处理组:5-Aza-CdR溶于生理盐水中，终浓度为5.0 μM;PDD处理组:PDD溶于生理盐水中，终浓度为15 μM;DAC与PDD同步处理组:DAC与PDD终浓度分别为2.5 μM 与8 μM;DAC与 PDD 序贯处理组:DAC(2.5 μM)处理24 h 再加 PDD(8 μM)处理 48 h;对照组:加入等体积的生理盐水。

1.3 检测方法 MDA-MB-231细胞用含10%胎牛血清的L-15培养液(不含酚红)于37°C、无CO2孵箱内培养。MTT法检测细胞生长抑制率，收集对数生长期细胞，用培养液制成单细胞悬液，细胞浓度调整为5×104个/mL，每孔100 μL接种于96孔板中，孵箱中过夜。处理组每孔加入100 μL培养液及药物，药物终浓度同1.2。对照组每孔加入等体积的培养液，每组设置6个复孔，48 h换培养液。细胞培养 20 h、44 h、68 h 后，每孔加入 20 μL MTT(5 mg/mL)，继续培养4 h后，弃培养液，每孔加入150 μL DMSO，慢速震荡10 min后，490 nm处测其吸光度(OD值)，计算肿瘤细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=(对照组OD值－处理组OD值)/对照组OD值×100%。利用金氏公式判断同步及序贯用药的效果，金氏公式如下:q=Ea+b/(Ea+Eb－EaEb)，式中，Ea+b是两药同步、序贯作用时的抑制率;Ea、Eb是两单药使用时的抑制率。若q＜0.85，表明两药联合作用有拮抗作用;0.85≤q≤1.15时，表明两药联合使用有相加作用;q＞1.15时，表明两药联合使用有增效的作用。

1.4 统计学方法 统计软件采用 SPSS16.0，计量资料用平均数±标准差(x±s)表示，结果采用oneway ANOVA中的SNK法检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，利用金氏公式判断同步、序贯用药的效果。

1.5 FCM检测细胞凋亡 细胞培养、处理、收集同上，按照说明书步骤操作，采用AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡，在FCM上用488 nm的激发光检测细胞凋亡情况。用Lysis软件分析细胞凋亡率。

2 结果

2.1 DAC与PDD对MDA-MB-231细胞增殖的影响 DAC组、PDD组、DAC+PDD组、DAC→PDD组细胞在24 h、48 h、72 h的细胞增殖抑制率见表1，DAC与PPD均有抑制MDA-MB-231细胞增殖作用，且随作用时间的延长抑制作用愈强，其中PPD较DAC抑制细胞增殖作用强(P＜0.01)。DAC+PDD组与DAC→PDD组在48 h、72 h的细胞增殖抑制率无显著性差异(均 P ＞0.05)，DAC+PDD 组、DAC→PDD 组在24 h、48 h、72 h 的 q 值分别为1.12、1.14、1.15 和0、1.12、1.17。DAC 与 PDD 无论同步还是序贯作用均有相加及增效作用。

2.2 DAC与PDD对MDA-MB-231细胞凋亡的影响 DAC组、PDD组、DAC+PDD组、DAC→PDD组细胞在24 h、48 h、72 h细胞凋亡率见表1，DAC与PPD均有促进MDA-MB-231细胞凋亡作用，各处理组细胞凋亡率均较对照组高(均P＜0.01)，其中PPD较DAC促进凋亡作用强(均P＜0.01)。在24 h、48 h DAC+PDD组较DAC→PDD组细胞凋亡率高(均P＜0.01)、72 h时两组细胞凋亡率则无显著差异(P=0.139)。

表1 各组在24 h、48 h、72 h的细胞增殖抑制率及细胞凋亡率

3 讨论

DAC是一种DNA甲基转移酶抑制剂，通过使基因启动子去甲基化而激活相应的基因表达。DAC已用于某些血液系统疾病的治疗，对用于实体肿瘤的治疗仍在试验中［2］。由于该药毒副作用大，用药剂量受限，严重影响了患者的依从性及其治疗效果。

铂类抗癌机制似烷化剂，主要作用靶点为DNA，作用于DNA链间及链内交链，形成DDP-DNA复合物，干扰DNA复制，或与核蛋白及胞浆蛋白结合。属周期非特异性药，常用于TNBC的治疗，尤其是BRCA1/2突变的TNBC［3］，但是对于非BRCA1/2突变的TNBC作用效果欠佳。其神经毒性、肾毒性较大及易耐药，限制了其用药时间、剂量及临床效果。

MDA-MB-231属TNBC细胞系，且BRCA1/2非突变，本研究发现DAC既能够抑制体外MDA-MB-231细胞的增殖，亦能促进其凋亡，随作用时间延长，效果愈明显。而PPD抑制MDA-MB-231细胞增殖，促进其凋亡的作用效果较DAC明显，两者有显著性差异。低剂量的DAC与PPD同步作用，其抑制增殖、促进凋亡的效果较单药明显增加，表现两药有相加、增效作用。低剂量的DAC与PPD序贯作用，DAC作用时间较短(仅仅24 h)，但作用效果并不差，且同样有相加、增效作用，72 h与同步作用的效果无显著性差别。Vijayaraghavalu等［4］报道的DAC与多柔比星序贯应用比同步应用效果更好，另外Tsai等［5］报道 DAC能维持其他化疗药物的疗效。以上结论与本研究结果相一致。

低剂量的DAC与低剂量的PPD联合应用可以明显增强两药的效果，为DAC的临床应用提供了新的前景，也为TNBC的治疗提供了新的希望。

［1］ Cleator S，Heller W，Coombes RC.Triple-negative breast cancer:therapeutic options［J］.Lancet Oncol，2007，8(3):235-244.

［2］ Momparler RL.Epigenetic therapy of cancer with 5-aza-2'-deoxycytidine(decitabine)［J］.Semin Oncol，2005，32(5):443-451.

［3］ Silver DP，Richardson AL，Eklund AC，et al.Efficacy of neoadjuvant Cisplatin in triple-negative breast cancer［J］.J Clin Oncol，2010，28(7):1145-1153.

［4］ Vijayaraghavalu S，Dermawan JK，Cheriyath V，et al.Highly synergistic effect of sequential treatment with epigenetic and anticancer drugs to overcome drug resistance in breast cancer cells is mediated via activation of p21 gene expression leading to G2/M cycle arrest［J］.Mol Pharm，2013，10(1):337-352.

［5］ Tsai HC，Li H，Van Neste L，et al.Transient low doses of DNA-demethylating agents exert durable antitumor effects on hematological and epithelial tumor cells［J］.Cancer Cell，2012，21(3):430-446.