建立一种加速剩余肝脏再生的大鼠模型

杨　勇，　杨　军，　丁　亮，　李向农，　庄　磊，　安华松，　汪　源，　韩亚东



论著

建立一种加速剩余肝脏再生的大鼠模型

杨勇，杨军，丁亮，李向农，庄磊，安华松，汪源，韩亚东

徐州，徐州医学院附属医院普外科(杨军，丁亮，李向农，韩亚东)

第一作者： 杨勇，男，江苏盐城人，硕士研究生,研究方向：肝胆胰外科，E-mail：446525059@qq.com

xnli2002@aliyun.com

【摘要】目的建立一种加速剩余肝脏(future liver remnaut volume， FLR)再生的大鼠模型。方法 雄性SD大鼠96只，应用计算机产生随机化数字进行完全随机化分组，分为3组，每组32只，即：肝脏离断+门静脉结扎组(LP+PVL组)、门静脉结扎组(PVL组)和假手术组(Sham组)。评估术后24 h、72 h、7 d 和10 d时各组FLR再生率、FLR重量/总肝重、肝功能变化和肝脏组织学改变。结果术后24 h、72 h、7 d 和10 d时，LP+PVL组的FLR再生率分别为(29.97±8.86)%、(76.67±9.58)%、(108.61±2.65)%和(117.21±2.66)%，明显高于PVL组(P<0.05)，FLR重量/总肝重也显示类似变化。LP+PVL组和PVL组的术后肝功能和剩余肝脏组织学检查均显示有一定损害，且以LP+PVL组明显；但两组均于术后10d恢复正常。结论肝脏离断加门静脉结扎能有效促进剩余肝脏再生，术后10 d FLR再生率可达117%、FLR重量/总肝重可达60%。

【关键词】肝脏离断；门静脉结扎；肝再生；大鼠；模型

肝切除术是原发性和继发性肝恶性肿瘤的首选根治方法，但仅10%的原发性肝癌和25%的转移性肝癌患者有手术机会[1]。这主要是由于多数患者就医时肿瘤较大或多发，广泛肝切除后残肝或称未来剩余肝脏体积(future liver remnant volume,FLR)过小而导致肝功能衰竭[2-4]。因此，足够的FLR是保障术后肝功能良好和提高大肝癌手术安全性的前提[5]。

促进FLR再生的传统方法是先行门静脉栓塞(Portal vein embolization, PVE)或门静脉结扎(Portal vein ligation, PVL)，待FLR增生到足够大时，再行二期肝切除术。但PVE和PVL的主要问题是促进FLR的再生能力有限，一般<50%；其次是肝再生速度慢，通常需4～8周[6-7]。2012年Schnitzbauer等[8]首先报道了联合肝脏离断和门静脉结扎的二步肝切除术(associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy, ALPPS)。此法最大的优势在于能够促进残肝快速再生，一期的肝脏离断和门静脉结扎(LP+PVL) 术后仅6～9天，FLR即可代偿性再生40%～160%[8-12]。

然而，LP+PVL促进FLR快速再生的机制研究甚少，原因之一是缺乏可靠、适用的动物模型。本文旨在通过联合肝脏离断和门静脉结扎的方法，建立一种促进FLR快速再生的大鼠模型，为ALPPS等相关研究提供实验工具。

1材料与方法

1.1动物分组健康雄性SD大鼠96只(由徐州医学院实验动物中心提供)，250～300 g，SPF级。应用计算机产生随机化数字进行完全随机化分组，将大鼠分为3组，每组各32只：LP+PVL组、PVL组、Sham组。

1.2模型建立大鼠术前禁食12 h，不禁水。腹腔注射5%水合氯醛(50 mg/100 g)麻醉。取上腹正中切口长约3 cm进腹。游离肝周韧带，充分显露肝脏。根据大鼠肝脏的正常解剖分叶，将其分为A、B两部分(图1)。PVL组，游离出A部的各肝叶门静脉分支，用5-0丝线结扎；门静脉结扎后于肝左、右中叶之间(镰状韧带右侧)迅速出现缺血线。LP+PVL组，则进一步沿上述缺血线两侧用6-0带线缝合针缝扎肝实质，显微剪刀剪断缝扎后的肝实质，循序渐进地劈开肝实质，直至下腔静脉前方；肝左、右中叶断面之间填塞可吸收止血纤丝，以防止术后肝断面粘连。Sham组，开腹后仅游离A部的门静脉分支，但不予结扎。检查各组腹腔无活动性出血，腹腔补充5 ml温生理盐水后关腹。

图1　模型制备示意图(彩图见网络版)

2结果

2.1肝脏大体结构改变及肝重变化实验中在体观察。本研究定义：“FLR再生率(%)=[(各组FLR重量占总肝重百分比-Sham组FLR重量占总肝重百分比的平均值)/ Sham组FLR重量占总肝重百分比的平均值]×100%”。术后24 h LP+PVL组和PVL组大鼠A部肝叶缺血后呈暗红色，灰暗；B部肝叶红润，呈充血状态，两组间外观大体相同，肝叶大小无明显差异。LP+PVL组和PVL组大鼠A部肝叶在术后72 h时略有萎缩，7 d萎缩明显，10 d更加明显；B部术后72 h时明显增大，7 d增大缓慢，10 d增大进一步缓慢。Sham组A部和B部肝叶都红润，各个时段肝脏比例无明显变化。各时段FLR再生率从高到低依次为LP+PVL组、PVL组、Sham组，术后24 h LP+PVL组和PVL组高于Sham组，差异有统计学意义(P<0.05)；但术后24 h LP+PVL组和PVL组FLR再生率，差异无统计学意义(P>0.05)；术后72 h、7 d和10 d各组间差异有统计学意义(P<0.05)(见表1，图2～图4)。

表1　各组FLR重量、FLR相对重量(每100 g鼠重)、FLR重量/总肝重及FLR再生率

注：*与Sham组比较P<0.05；#与PVL组比较P<0.05。

图2　Sham组肝脏大体结构图片

2.2血清ALT、AST、ALB、TBIL水平术后24 h大鼠血清ALT、AST水平从高到低依次为LP+PVL组、PVL组、Sham组，各组间差异有统计学意义(P<0.05)；而术后72 h、7 d和10 d大鼠血清ALT、AST水平，各组差异无统计学意义(P>0.05)。术后24 h、72 h大鼠血清ALB水平从高到低依次为Sham组、PVL组、LP+PVL组，各组间差异有统计学意义(P<0.05)；术后7 d，大鼠血清ALB水平

图3～4　LP+PVL组和PVL组肝脏大体结构变化图片

LP+PVL组和PVL组仍低于Sham组(P<0.05)，LP+PVL组和PVL组间差异无统计学意义(P>0.05)；术后10 d 3组间差异无统计学意义(P>0.05)。3组各时段大鼠血清TBIL水平差异无统计学意义(P>0.05)(见表2～表5)。

表2　各组血清ALT含量检测结果

注：*与Sham组比较P<0.05；#与PVL组比较P<0.05。

表3　各组血清AST含量检测结果

注：*与Sham组比较P<0.05；#与PVL组比较P<0.05。

表4　各组血清ALB含量检测结果

注：*与Sham组比较P<0.05；#与PVL组比较P<0.05。

表5　各组血清TBIL含量检测结果

2.3肝组织光学显微镜检查光镜下Sham组肝小叶结构基本正常。LP+PVL组和PVL组A部肝脏术后24 h、72 h肝细胞核固缩，胞浆红染，炎细胞浸润；术后7 d、10 d肝细胞大片凝固性坏死，坏死部分开始被吸收，肝叶纤维化，LP+PVL组的A部坏死区域明显多于PVL组。LP+PVL组和PVL组B部肝脏术后24 h、72 h肝细胞再生明显，可见肝细胞核分裂相，汇管区、小叶间血管扩张充血，肝血窦明显增宽；术后7 d、10 d后肝细胞核分裂水平逐渐下降，基本接近正常结构形态。

3讨论

本研究选择大鼠肝中叶进行肝脏离断和门静脉结扎，是因为该肝叶较大且浅表，易于操作。更为重要的，是因为唯有肝中叶具有两个门静脉分支，并分别向肝左、右中叶独立供血[13]。因此，结扎本模型中A部的各肝叶门静脉分支不会造成肝右中叶(B部或FLR)的门静脉缺血。

当大鼠A部各肝叶的门静脉分支被结扎，肝左、右中叶的肝实质离断后，A部仅有肝动脉供血，而B部或FLR则保留门静脉和肝动脉双重血供；这与临床上ALPPS一期手术后的情况相同[14]。如同预期，术后24 h LP+PVL组的FLR再生率达30%、FLR重量/总肝重即由正常时(Sham组)的25%上升至33%，而至10 d时FLR再生率高达117%、FLR重量/总肝重进一步上升至60%。虽然单纯门静脉结扎也能够促进剩余肝脏再生，但无论再生速度或程度均不及LP+PVL组。

联合肝脏离断和门静脉结扎能够促进剩余肝脏快速再生的机制尚不清楚。可能的机制包括[15]：(1)门静脉分支结扎后，全部门静脉血液均流向剩余肝脏；(2)剩余肝脏获得更多肝营养因子；(3)肝脏离断为剩余肝脏快速再生提供了足够的刺激。本实验结果显示，LP+PVL组血清ALT和AST水平在术后第一天达到高峰，并远高于PVL组；说明肝脏离断对肝脏造成了较为明显的急性损伤[16]，可能与剩余肝脏再生的快速启动有关。

本模型术中操作需注意以下几点：(1)充分暴露腹腔后，在腰背部垫一腰桥(5 ml注射器)以抬高上腹部，使肝脏连同肝门部脉管系统整体下移；(2)在剪断肝镰状韧带近膈顶部位时，应注意勿损伤左膈静脉(左膈静脉在此处汇入肝上下腔静脉)，以免造成严重出血；(3)离断肝实质时，先用一个显微镊子压榨肝实质，再用6-0带线缝合针沿缺血线左、右侧缝扎肝实质，以减少出血；(4)肝脏离断后应以止血材料填塞于肝断面之间，以防术后断面粘连。

总之，本研究成功建立了一种促进剩余肝脏快速再生的大鼠模型，术后10 d剩余肝脏再生率可达117%；剩余肝脏重量/总肝重由正常时的25%快速升至60%，同时肝功能基本恢复正常。

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作者单位：221002江苏徐州，徐州医学院研究生学院(杨勇，庄磊，安华松，汪源)； 221002江苏

通讯作者：李向农，男，江苏徐州人，博士，教授，主任医师，硕士研究生导师,研究方向：肝胆胰外科，E-mail：

doi：10.3969/j.issn.1674-4136.2016.02.010

文章编号：1674-4136(2016)02-0108-05

Corresponding author:LI Xiangnong, E-mail：xnli2002@aliyun.com

[收稿日期：2015-12-29] [本文编辑：李庆]

Establishment of a rat model of accelerating future liver remnant regeneration

YANGYong1,YANGJun2,DINGLiang2,LIXiangnong2,ZHUANGLei1,ANHuasong1,WANGYuan1,HANYadong2.

(1.TheGraduateSchoolofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou221002,China; 2.DepartmentofGeneralSurgery,TheAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou221002,China)

Abstract：ObjectiveTo establish a rat model of accelerating future liver remnant(FLR) regeneration. Methods96 male SD rats were randomly divided into the following three groups(32 rats each group): liver partition+portal vein ligation (LP+PVL group), portal vein ligation (PVL group) and sham-operated group (Sham group). The changes of the regeneration rate of FLR, FLR weight/total liver weight, the liver functions, and the liver histopathology were measured after 24 h, 72 h, 7 d and 10 d in each group. ResultsAfter 24 h, 72 h, and 7 d and 10 d, the regeneration rate of FLR were (29.97±8.86)%、(76.67±9.58)%、(108.61±2.65)% and (117.21±2.66)% in LP+PVL group, significantly higher than the PVL group (P<0.05), FLR weight/total liver weight also showed similar changes. The liver functions and the liver histopathology all showed there were some damage after operation in LP+PVL group and PVL group, and LP+PVL group was significant. However, both groups returned to normal after 10 d. ConclusionsLiver partiton and portal vein ligation can effectively promote future liver remnant regeneration. The regeneration rate of FLR can be up to 117%, and FLR weight/total liver weight can be up to 60% after 10d.

Keywords：Liver partition;Portal vein ligation;Liver regeneration;Rat;Model