CD88在胃癌组织中的表达及其对细胞侵袭能力的影响

柯少迎，　苏子剑，　叶晓楠，　翟军伟，　张剑华，　刘小瑜，　王聪仁，　潘群雄



论著

CD88在胃癌组织中的表达及其对细胞侵袭能力的影响

柯少迎，苏子剑，叶晓楠，翟军伟，张剑华，刘小瑜，王聪仁，潘群雄

目的观察CD88在胃癌组织中的表达水平，探索CD88的表达水平对胃癌细胞侵袭能力的影响及其机制。方法采用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)和Western blot方法检测CD88在癌及癌旁组织中mRNA和蛋白的表达水平。使用CD88特异性小干扰RNA(siRNA)转染人胃癌细胞株SGC7901, 然后采用划痕及transwell方法检测细胞侵袭能力改变。结果在胃癌组织中，CD88 mRNA和蛋白表达水平明显比癌旁组织高，沉默CD88后，SGC7901的侵袭迁移能力明显减弱。结论CD88在胃癌中表达增加，并可增强胃癌细胞的侵袭迁移能力，可为胃癌的靶向治疗研究提供新的靶点。

胃癌；CD88表达；侵袭；免疫组化；小干扰RNA；肿瘤标记物

最近有研究发现CD88在炎症过程参与细胞和血管生成，通过影响微环境参与恶性肿瘤进展过程。而关于CD88与胃癌细胞侵袭迁移的关系目前还不清楚。本项目检测胃癌组织中CD88的表达，采用RNA干扰(RNAi)技术敲减了胃癌细胞株SGC7901中CD88表达，观察敲减前后胃癌细胞侵袭迁移能力的改变，探讨CD88在胃癌进展中的作用及其机制。

1　材料与方法

1.1一般资料胃癌SGC7901细胞株(福建医科所惠赠)，ECL发光液、显影液、RNA抽提试剂盒、cDNA逆转录试剂盒、PCR试剂盒(碧云天)，CD88 siRNA及control siRNA均购自上海吉凯公司。选择2013年5月至2015年8月于泉州第一医院住院手术切除并经病理确诊的胃癌患者70例，其中男42例，女18例，平均年龄(61.3±11.1)岁。患者术前均未接受过针对肿瘤的治疗。每例均取癌组织及癌旁组织(距癌组织边缘>2 cm )各1份(1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm)，标本投入液氮速冻后转入-80℃低温冰箱保存。本研究获得本院伦理委员会批准并获得患者同意。

1.2细胞株及细胞培养将胃癌SGC7901细胞株于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养基中培养，在5%CO2，37 ℃恒温中孵育。用含0.02%乙二胺四乙酸二钠(EDTA)的0.25%胰蛋白酶溶液消化传代。

1.3CD88基因的siRNA序列设计与载体构建CD88基因的siRNA靶序列由上海吉凯基因化学公司设计，在Genebank用BLAST比对非特异结合。DNA单链在退火缓冲液中经94 ℃预变性5 min后进入56 ℃退火，在体外形成DNA双链。Hind Ⅲ和BamH I双酶切pSilencerTM3.1-H1质粒后，与siRNA双链DNA连接、转化DH5et感受态细胞。挑菌测序。

1.4CD88基因沉默胃癌细胞模型建立按试剂盒提取纯化pSilencer.CD88和pSilencer质粒，与上海吉凯基因化学公司提供的无关序列siRNA(control siRNA)定量后按照LipofectAMINE 2000的说明书转染SGC7901细胞。转染后按1×105个细胞接种于60 mm的培养皿中，于24、48、72 h时间段收集细胞提取RNA和蛋白，采用RT-PCR和Western印迹法检测其CD88的表达状况，验证沉默效率。

1.5Western blot检测胃癌及癌旁组织中CD88的表达临床胃癌及癌旁组织经组织裂解液裂解，取样品处理液进行SDS-PAGE电泳、转膜，用含5%脱脂牛奶的TBST溶液封闭1 h。洗膜后加入鼠抗人CD88单克隆抗体(1∶800，Abcam)4 ℃孵育过夜。洗膜后加入HRP标记羊抗鼠IgG聚合物(1 ∶5 000，Abcam)室温孵育1 h。洗膜后加入ECL，显影、洗片、晾干。用凝胶图像分析仪扫描照片，并采用灰度分析软件计算各蛋白条带的灰度值。

1.6RT-PCR检测胃癌及癌旁组织中CD88的表达 试剂盒提取胃癌及癌旁组织中总RNA，逆转录获得cDNA。Genebank中查找各基因序列，Primer5.0设计CD88引物序列。CD88上游引物序列为：5′-CCCTCAATGTCTAACCAA-3′，下游引物为5′-GAGTGTAGCGTGAATAGC-3′。PCR反应体系为：10×Taq Buffer5 μl, 10 mM dNTP Mix 4.0 μl, 10 μM上下游引物各2 μl, 模板4 μl, 5 U/μl Taq 0.5 μl, ddH2O 32.5 μl, 共50 μl。PCR产物在1.3%琼脂糖凝胶中，4 V/cm电泳40 min后，凝胶成像系统拍照并采用灰度分析计算产物条带灰度值。

2　结果

2.1RT-PCR检测胃癌及癌旁组织中CD88 mRNA的表达结果显示，内参基因actin扩增产物在所有组织中均有稳定表达(图1A)。Real-time PCR结果显示胃癌组织CD88的mRNA水平(1.03±0.13)明显高于癌旁组织(0.62±0.05)(图1A,1B)，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1　A：CD88 mRNA的RT-PCR电泳；

2.2Western blot检测胃癌组织和癌旁组织CD88蛋白表达5对癌及癌旁组织内参基因actin扩增产物在所有组织中均有稳定表达(图2)。Western blot结果显示胃癌组织CD88蛋白表达水平明显高于癌旁组织。

图2　Western blot检测癌和癌旁组织中CD88蛋白表达水平(T：癌组织；N：癌旁组织)

2.3CD88-siRNA转染对SGC7901细胞侵袭和迁移能力的影响CD88-siRNA转染SGC7901细胞后，细胞迁移能力[(19.2±2.0)个]明显弱于对照组[(50.32±4.32)个](图3)，差异具有统计学意义(P<0.05)。沉默CD88后，SGC7901的侵袭能力也明显降低(图4)。

图3　划痕实验结果(光镜，×20)。显示沉默CD88后癌细胞的迁移能力明显降低。

图4　Transwell侵袭实验结果(光镜，×20)。显示沉默CD88后癌细胞的侵袭能力明显降低。

3　讨论

有证据表明，炎症反应可能起着促进肿瘤进展[1]或者抑制肿瘤进展[2]的作用，补体系统C5a及其配体CD88在多种炎症过程中起着重要的作用，然而，有关CD88与肿瘤的作用的研究尚少。

对于CD88在肿瘤中的表达，研究证实在肝细胞癌中CD88在肿瘤细胞中呈功能性表达[3]。在结肠腺癌、肝内胆管细胞癌、肾透明细胞癌、乳腺癌和前列腺癌中，与正常组织相比，CD88在癌细胞中呈强阳性表达，并在肝内胆管细胞癌中发现有肿瘤血管浸润者的CD88明显呈强阳性表达[4-5]。应用RT-PCR技术在15例犬乳腺癌动物模型中检测到CD88 mRNA表达，同时发现CD88的表达与肿瘤进展呈正相关，包括浸润性导管癌和浸润性小叶癌；在乳腺纤维腺瘤中观察到CD88弱表达，而在犬正常乳腺组织中未表达[6]。在非小细胞肺癌上同样观察到CD88在癌细胞上高表达并与淋巴结转移相关[7]。在体外实验中发现CD88表达可促进胆管细胞癌细胞系的能动性、侵袭能力和细胞骨架的改变[4]。我们应用Real-time PCR和Western blot检测胃癌及癌旁组织中CD88 mRNA和蛋白的表达，发现胃癌组织表达明显比癌旁组织高，应用CD88-siRNA转染SGC7901细胞后，与对照组比较，转染CD88-siRNA的细胞迁移能力明显减弱，从而表明CD88过表达可能促进肿瘤侵袭转移，而抑制CD88表达肿瘤细胞侵袭转移能力可能降低。由此提示在胃癌的发生发展过程中CD88可能起重要作用。

对于CD88促进肿瘤侵袭转移的机制，目前尚不清楚。有学者观察到表达CD88前列腺癌细胞的侵袭能力能被C5a激活，并被基质金属蛋白酶抑制剂抑制[8]。CD88表达可促进人黏液表皮样癌基质金属蛋白酶的分泌从而增强侵袭能力[6]。有学者发现，CD88可能通过影响T细胞而影响肿瘤免疫[6]。细胞内CD88参与调控T细胞的活化和分化[9]。在小鼠乳腺癌动物模型上观察到CD88过表达，通过促进抗肿瘤免疫而抑制小鼠乳腺癌的生长[10]。相反，在小鼠宫颈癌动物模型中观察到通过药物阻断CD88-C5a相互作用，可募集髓源性抑制细胞进入肿瘤，放大T细胞介导抗肿瘤反应，从而促进肿瘤免疫逃避和生长[5]。

综上所述，炎症反应与肿瘤关系密切，特别是补体系统。对CD88的研究将不仅有助于人们更了解肿瘤发生发展的分子机制，还能促进新的抗癌药物和治疗方法的开发和出现。

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Expression of CD88 and its effect on invasiveness of gastric carcinoma

KEShaoying1,SUZijian1,YEXiaonan1,ZHAIJunwei2,ZHANGJianhua1,LIUXiaoyu1,WANGCongren1,PANQunxiong1.

(1.DepartmentofOncologySurgery,AffiliatedQuanzhouFirstHospitalofFujianMedicalUniversity,Quanzhou362000,China；2.DepartmentofSurgery,TengzhouCentralPeople’sHospital，Tengzhou277500，China)

PANQunxiong,E-mail：panqunxiong@126.com

ObjectiveTo study the expression level of CD88 in gastric cancer and normal tissue. To investigate the affection and mechanism of CD88 on migration and invasion activity of gastric cancer cell.MethodsThe different expression of CD88 protein levels in gastric carcinoma tissues and peritumoral tissues were determined by RT-PCR and Western blot respectively． After transfected with CD88 specific small interfering RNA(CD88-siRNA), the ability of migration and invasion of SGC7901 were examined by wound scratching and transwell assay.ResultsThe CD88 mRNA expression was significantly higher in gastric carcinoma tissues than that in the peritumoral tissues. CD88-siRNA can obviously inhibit cell activity of invasion and migration of SGC7901.ConclusionsThe expression levels of CD88 was increased and significantly enhanced the ability of invasion and migration in gastric cancer cell. This study provide new target for the treatment of gastric cancer.

Gastric cancer;CD88;Invasion;Immunohistochemistry；siRNA；Tumor marker

福建省自然科学基金(2014J01435)； 泉州市科技计划项目(2013Z58)

362000福建泉州，福建医科大学附属泉州第一医院肿瘤外科(柯少迎，苏子剑，叶晓楠，张剑华，刘小瑜，王聪仁，潘群雄)； 277500山东滕州，滕州市中心人民医院外科(翟军伟)

柯少迎，男，住院医师，研究方向：肿瘤外科，E-mail： 44633091@qq.com

潘群雄，男，本科，主任医师，教授，主要从事肿瘤侵袭转移的研究，E-mail：panqunxiong@126.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2016.03.007

1674-4136(2016)03-0169-04

2016-01-09][本文编辑：李筱蕾]