纳米炭混悬液在术中探寻非小细胞肺癌前哨淋巴结的应用

张建鹏， 邹 卫， 王科平， 刘 锋， 马国栋， 曹 磊

纳米活性炭作为一种淋巴示踪剂在胃癌、结肠癌、乳腺癌等肿瘤外科的临床应用上取得了较为肯定的效果[1]，然而将纳米活性炭应用于非小细胞肺癌(NSCLC)外科治疗的报道较少，本实验就纳米炭混悬液在术中探寻NSCLC前哨淋巴结(SLN)中的应用进行初步探索。

1 资料与方法

1.1 对象入选标准 (1) 术前明确诊断或高度怀疑非小细胞肺癌。(2) 术前常规检查胸部CT：孤立性病灶，无其他组织侵犯，肺门淋巴结最大直径≤1.5 cm，纵隔淋巴结最大直径≤1.0 cm。(3) PET/CT、头颅CT(或MRI)、骨ECT、腹部B超、泌尿系统B超或上腹部CT排除远处转移。(4) 常规心电图、超声心动图、肺功能、血气分析排除手术禁忌。(5) 术前未进行放、化疗。(6) 无严重心、肝、肾、造血系统及精神、神经系统疾病。

1.2 入选对象一般资料 2008年11月至2009年10月南京胸科医院胸外科收治的20例临床诊断NSCLC患者，其中男性13例，女性7例，中位年龄63.4岁(48～74岁)。术前经CT引导下经皮肺穿刺活检、纤维支气管镜活检病理确诊NSCLC 14例，PET/CT等高度怀疑NSCLC 6例。术前病理分期(cTNM分期)：Ⅰ期10例，其中ⅠA(T1N0M0)3例，ⅠB(T2N0M0)7例；Ⅱ期10例，其中ⅡA(T1N1M0)4例，ⅡB(T2N1M0)6例。

1.3 试剂 纳米炭混悬注射液(商品名卡纳琳，Carbon Nanoparticles suspension Injection，CNP)，重庆莱美药业有限公司生产。免疫组化试剂：抗角蛋白免疫组化试剂盒购自北京中山生物技术有限公司，包括：(1) 一抗为鼠抗人细胞角蛋白(CK AE1/AE3) 单克隆抗体；(2) 封闭用正常羊血清工作液；(3) 生物素标记羊抗鼠IgG；(4) 辣根酶标记的链霉素卵白素。

1.4 操作方法 常规开胸，评估能否应用纳米炭混悬液并确定手术方式后于肿瘤与正常组织交界处在正常侧以注射针斜行刺入并缓慢注射纳米炭混悬液，依据肿瘤大小于肿瘤边缘、肿瘤表面脏层胸膜下多点注射，注射深度约0.5 cm，注射时间为15 min，注射后等待染色15 min。所有患者行标准的肺叶切除术与系统性纵隔淋巴结廓清术。右侧肺癌廓清2～4组，7～9组淋巴结；左侧肺癌廓清5～9组淋巴结。依据术中探查情况，酌情廓清其他组淋巴结。肺叶切除后，台下继续解剖肺内淋巴结。SLN定义：(1)淋巴结黑染明显且具油性光泽；(2)将所取淋巴结纵行剖开，以纱布轻拭淋巴结剖面，有纳米炭混悬液痕迹者。将所获淋巴结送HE染色检查，对所有HE染色检查阴性的淋巴结行抗角蛋白免疫组化染色及连续切片检查。

1.5 SLN 评价标准 参照美国Louisville大学的

SLN评价标准。SLN阳性为SLN有转移。SLN阴性为SLN及SLN所在区域淋巴结均无转移。假阴性为SLN所在区域淋巴结有转移而SLN无转移。敏感性=SLN 阳性病例数/淋巴结转移病例总数×100%。准确率=(SLN阳性病例数+SLN阴性病例数)/SLN检出总例数×100%。假阴性率=SLN假阴性病例数/淋巴结转移病例总数×100%。

2 结果

入选20例患者中4例患者因术中胸腔内粘连，放弃应用纳米炭混悬液。行纳米炭混悬液淋巴示踪的16例患者术后病理学诊断鳞癌8例，腺癌5例，腺鳞癌1例，低分化癌1例，机化性肺炎1例。15例NSCLC患者中，右上肺癌5例，右下肺癌4例，左上肺癌4例，左下肺癌2例。周围型9例，中央型6例。术后病理分期(pTNM 分期)：Ⅰ期7例，ⅠA期(T1N0M0)3例(cTNM ⅡA降1例)，ⅠB期(T2N0M0)4例；Ⅱ期6例，ⅡA期(T1N1M0)2例，ⅡB期(T2N1M0)4例(cTNMⅠB升1例)；ⅢA期2例：T1N2M01例(cTNMⅠA升1例)，T2N2M01例(cTNMⅠB升1例)。肿瘤最大直径平均为3.1 cm±1.37 cm(1.8～6.4 cm)。

15例NSCLC患者共检出淋巴结203枚，平均每例13.5枚。共检出SLN 22 枚(见表1、表2)，占淋巴结总数的10.8%，其中N114枚，N28枚。SLN病理阳性9枚，其中2枚为跳跃性转移。15例患者中有11例成功识别SLN，识别率为73.3%(11/15)，其中有3例检出1枚SLN，5例检出2枚SLN，3例检出3枚SLN。11例检出SLN患者中，有6例SLN阳性。其中SLN阳性，NSLN也有转移者2例(pTNM ⅢA 2例)；4例仅为SLN阳性，NSLN无转移(pTNM ⅡA 2例，ⅡB 2例)；4例 SLN无转移，NSLN亦无转移(pTNM ⅠA 2例，ⅠB 2例)；1 例SLN 无转移，NSLN 淋巴结转移(pTNM ⅡB 1例)。4例患者未检出SLN，pTNM ⅠA 1例，ⅠB 2例，ⅡB 1例。本组SLN 检测敏感度为85.7%(6/ 7)，准确率为90.9%(10/11)，假阴性率为14.3%(1/7)。

本实验16例应用纳米炭混悬液患者均未见药物过敏反应与相应的肝肾功能不全表现。1例患者术后出现乳糜胸，保守治疗后痊愈出院。

表1 SLN分布

*为跳跃性转移淋巴结

表2 病理阳性SLN分布

*其中有2枚跳跃性转移淋巴结

3 讨论

SLN最初由Busch等[2]报道，是指原发肿瘤的局部淋巴循环中出现的第一个或第一组淋巴结，即淋巴回流最先到达的淋巴结，它首先接纳肿瘤细胞并能限制其进一步转移，其病理学状态可代表整个区域淋巴结状态。通过肺淋巴回流规律的研究，NSCLC前哨淋巴结逐步进入人们的视线。目前常用的NSCLC前哨淋巴结检测技术有核素法和应用异硫蓝等染色剂的染色法，其中核素法检测SLN识别率、准确性和特异性较高[3]。但核素法检测需要特殊的设备，且需要对核放射性原料进行特殊管理，难以在国内普遍开展。染色法简便易行，相对于核素法有其技术优势。纳米炭混悬液中的活性炭微粒可被巨噬细胞吞噬，具有淋巴趋向性且染色醒目，故本实验选用纳米炭混悬液作为淋巴示踪剂。

3.1 纳米炭混悬液染色法的特点及应用 本组SLN识别率为73.3%(11/15)，与国内外研究相比有较高的SLN识别率(见表3)。我们体会：(1)纳米炭虽无明显的副反应，但对于术中探查胸腔有粘连者，由于分离粘连可能造成脏层胸膜与肺实质内淋巴回流通路破坏而影响纳米炭混悬液淋巴示踪效果，应列为禁忌。(2)纳米炭混悬液因其理化特性染色能力强，多点注射不会影响其淋巴示踪效果。我们依据肿瘤大小一般采取6～8点注射，充分利用肿瘤所在区域淋巴管及其交通支。有资料表明[4]对周围型NSCLC胸膜下注射示踪剂有助于提高纵隔SLN识别率，本组9例周围型NSCLC均采取瘤周+肿瘤对应脏层胸膜下注射方法。(3) 由于胸腔较深，宜选用儿科头皮针，注射方便且易于控制。应准确定位肿瘤边缘，进针不宜过深，注射前回抽，避免误注入血管或支气管内。缓慢注射，避免纳米炭混悬液反溢。(4)Bustos等[5]报道肺内、纵隔淋巴结颜色较深，染色SLN难以通过视觉辨别，从而使SLN识别率受到影响，限制了染色法的应用。而我们发现被纳米炭混悬液染色的淋巴结有特殊的油性光泽，区别于一般淋巴结；将SLN纵行剖开，以纱布轻拭其剖面，有纳米炭混悬液痕迹，此法简便易行，可较为准确地判定SLN，消除视觉误差，提高SLN识别率。

表3 染色法探寻NSCLC前哨淋巴结

本实验有4例患者未找到SLN，分析原因可能为：(1)4例患者中有3 例为中央型NSCLC，由于肿瘤位置较深，不易分辨肿瘤与正常组织的交界，难以准确将纳米炭混悬液注射至瘤周，故中央型NSCLC在使用染色法探寻SLN时可能存在操作上的困难。但本实验后期3例中央型NSCLC均成功识别SLN，说明经验积累有助于克服操作上的困难。(2)4例均为此技术开展后早中期病例，反映了掌握此技术的正常学习曲线。

本实验SLN检测敏感度为85.7%(6/7)，准确率为90.9%(10/11)，假阴性率为14.3%(1/7)，较为准确地反映了NSCLC区域淋巴结的转移情况。随着对纵隔淋巴结的功能及纵隔淋巴结廓清术后并发症的认识，已有部分学者依据SLN转移情况行限制性纵隔淋巴结廓清术或采样术。Tatsuya等[10]对早期NSCLC区域淋巴结转移阴性的患者采取了限制性的纵隔淋巴结切除术，Muraoka等[11]对I期NSCLC患者依据SLN转移情况行纵隔淋巴结采样术，均获得了满意的生存率。这些依靠SLN检测技术而实施的限制性纵隔淋巴结廓清术或采样术对早期NSCLC患者尤其是一般状态较差、高龄、术前肺功能偏差、合并其他脏器功能不全的患者不失为一种合适的外科治疗方式。本实验初步表明，应用纳米炭混悬液术中探寻NSCLC前哨淋巴结具有较高的SLN识别率及区域淋巴结转移预测性，是一种实用的判断区域淋巴结状态的方法，有望成为指导限制性纵隔淋巴结廓清术或采样术的依据，但仍需进一步大样本研究证实。

3.2 纳米炭混悬液探寻跳跃性转移SLN的应用 NSCLC具有较高的跨区域及跳跃性转移率，NSCLC前哨淋巴结有无限制肿瘤细胞进一步转移的能力是决定NSCLC前哨淋巴结检测技术应用价值的一个核心问题。有学者[12]认为病理条件下肿瘤压迫，瘤栓阻塞淋巴管以及肺内一些直接引流至纵隔的淋巴通道是造成NSCLC淋巴结跨区域及跳跃性转移的原因，而并非肺内、纵隔淋巴结对肿瘤细胞无限制作用。本实验共检出N2SLN 8枚，病理阳性淋巴结3枚，其中2枚跳跃性转移淋巴结。结合纳米炭在肿瘤外科的应用经验[1]，其具有组织局部淋巴结停留时间长的特点，不会迅速迁移至下一站淋巴结。术中发现纵隔SLN，可能意味着存在病理条件下开放的引流肿瘤区域的淋巴通道以及肺内一些直接引流至纵隔的淋巴通道，应引起特别重视，尤其是对cTNMⅠ期NSCLC患者。本实验中有1例cTNMⅠA患者检测出2枚跳跃性转移SLN。对于此种情况，利用连续切片、免疫组织化学或RT-PCR等技术重点检测SLN，提高淋巴结微转移的检出率，制定更为合理的治疗方式，改善患者预后，可能是一种行之有效的方法[13]。

本实验结果提示，应用纳米炭混悬液术中探寻NSCLC 前哨淋巴结简单、有效、安全，有望在NSCLC淋巴结廓清、区域淋巴结状态判断、综合治疗方案制定等方面发挥重要作用。然而将纳米炭混悬液应用于NSCLC外科治疗的报道并不多，其效果有待进一步评价。

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