西妥昔单抗诱导人鼻咽癌细胞株CNE凋亡实验研究

徐寒子

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我国南方常见恶性肿瘤,发病率高达10～30/10万，放射治疗是其主要治疗手段，然而疗效不尽人意，5年生存率多年来徘徊在50%[1]。因此，寻找治疗鼻咽癌的新药，是当前鼻咽癌防治研究的热点。近年来恶性肿瘤最大的治疗进展莫过于针对不同靶点的新型靶向药物的不断开发与使用，其中作用于表皮生长因子受体(EGFR)的靶向药物是较为重要的一类[2-3]。研究表明，EGFR单克隆抗体之一的西妥昔单抗能显著抑制包括肝癌、鼻咽癌在内的多种肿瘤细胞的生长。我们的前期工作已证实，西妥昔单抗对人鼻咽癌细胞株CNE存在一定的抑制作用[4]，本研究旨在探讨其对CNE细胞的凋亡诱导效应及其分子机制，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 材料 注射用西妥昔单抗(2 mg/mL)为美国ImClone公司产品，RPMI 1640系GIBCO公司产品，胎牛血清购自杭州四季青公司，胰蛋白酶、Hoechst 33258购自SIGMA公司，AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒购自美国BIPEC公司，鼠抗Bax、Bcl-2单抗购自SANTA CRUZ公司，鼠抗β-Actin单抗购自联科生物，羊抗鼠IgG-Ap抗体、显色试剂盒购自武汉华美生物。

1.2 细胞培养 人鼻咽癌细胞株CNE购于中科院上海细胞库，生长在含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液中，于37℃恒温、5%CO2、饱和湿度培养箱中，每2～3 d换液传代1次。取对数生长期细胞用于实验。

1.3 荧光染色法观察CNE细胞凋亡形态 将干净无菌的盖玻片置于30 mm2培养皿，取对数生长期的细胞，按105/皿的密度接种于培养皿，培养过夜。待细胞爬片融合达50%～80%时，小心更换培养液后分别加入终浓度为10 μg/mL的西妥昔单抗(实验组)或等量的无血清培养基(对照组)，继续培养48 h后吸尽培养液，PBS洗2次，加入Hochest 33258染液(5 mg/L)室温避光染色10 min，双蒸水洗涤，吸去多余液体后封片，在荧光显微镜下(德国Leica)观察并随机拍照。

1.4 透射电镜观察细胞凋亡超微结构 接种1×106/mL细胞于培养瓶，分别加入终浓度为10 μg/mL的C225或等体积的无血清培养液，培养48 h后以戊二醛和锇酸固定，丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋，超薄切片机切片，经醋酸铀、柠檬铅双染后上透射电镜(日本HITACHI)观察细胞超微结构变化。

1.5 流式细胞术检测凋亡率 细胞处理同1.3，48 h 后消化收集细胞；冷PBS洗2遍，用Binding缓冲液重悬调整细胞密度为1×106/mL，取100 μL悬液，先后加入5 μL细胞凋亡检测试剂Annexin V-FITC和10 μL PI并分别于4℃避光孵育5 min，上流式细胞仪(BD，美国)检测。实验重复3次，以均值代表测定结果。

1.6 Western Blot分析Bax、Bcl-2蛋白的表达 接种1×106/mL细胞于培养瓶，分别加入终浓度为1、10、100 μg/mL的西妥昔单抗或等量的无血清培养基(对照组)，继续培养48 h后收集细胞，加入400 μL裂解液冰上裂解30 min，4℃12 000rpm离心5 min 取上清液，95℃变性5 min，蛋白定量后加上样缓冲液调整至浓度相同。各取15 μL，经SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入对应的一抗溶液，4℃孵育过夜，TBST振荡洗涤15 min，3次后加入二抗，室温孵育2 h，TBST振荡洗涤15 min，3次，AP显色。运用图像分析仪(上海培清，A-380)对结果进行图像分析，计算条带的积分吸光度，以β-Actin水平作为等量蛋白上样参照。实验重复3次，以均值代表测定结果。

2 结果

2.1 Hochest 33258结果 Hochest 33258是一种亲核染料，被活细胞摄取后在荧光显微镜下观察, 正常细胞呈均匀的浅蓝色荧光，细胞边缘整齐；凋亡细胞核染色质因固缩而呈致密浓染，或因胞核碎裂而呈大小不等的圆形小体(凋亡小体)。本实验对照组可见活细胞核呈均匀的蓝色荧光，未见凋亡细胞(图1-A)；而西妥昔单抗处理组可见较多凋亡细胞，胞核碎裂凝集成典型的凋亡小体(图1-B箭头标注处)。

图1 Hochest 33258染色对照组(A)西妥昔单抗实验组(B) CNE凋亡形态学改变(×400)

2.2 透射电镜结果 透射电镜观察发现对照组CNE细胞表面有长短不一的微绒毛伸展，细胞核核膜清晰，染色质呈细颗粒状，核仁清晰，未见典型细胞凋亡超微结构改变(图2-A)；而西妥昔单抗组CNE细胞微绒毛消失，内质网扩张，胞质浓缩，胞核深染，核染色质固缩成块并边集，出现凋亡小体(图2-B箭头标注处)。

图2 透射电镜对照组(A)西妥昔单抗实验组(B) CNE细胞凋亡形态学改变(×6000)

2.3 AnnexinV-PI双染流式检测结果 经AnnexinV-FITC和PI双染色后，在FCM图上表现为AnnexinV-FITC阳性而PI阴性的细胞，即为处于早期凋亡阶段而非死亡的细胞。经西妥昔单抗作用48 h后，CNE细胞凋亡率为(15.30±0.95)% (图3-A、B、C)，显著高于对照组的(4.70±0.60)% (图3-D、E、F)。

图3 对照组(A、B、C)西妥昔单抗组(D、E、F)部分流式细胞检测结果

2.4 Western Blot结果 以Western Blot方法分析西妥昔单抗作用CNE细胞48 h后Bax、Bcl-2蛋白表达情况，结果显示：Bax蛋白(23kd)随浓度的增加而逐渐上调，而Bcl-2蛋白(26kd)则刚好相反，随浓度的增加而逐渐下调(图4-A)；以β-Actin水平为等量蛋白上样参照，分析Bax/Bcl-2比值变化情况，结果显示：西妥昔单抗组显著高于对照组(P<0.05)，并随浓度的增加而逐渐升高，处理组间差异存在统计学意义(图4-B)。

图4 Bax、Bcl-2蛋白表达Western Blot结果#表示较对照组(0 μg/mL)有显著差异(P<0.05)，*表示处理组间有显著差异(P<0.05)

3 讨论

目前靶向EGFR治疗的药物主要有两类, 一种为针对EGFR胞内部分的小分子酪氨酸激酶抑制剂，如厄洛替尼，此类药物可与ATP竞争EGFR胞内部分酪氨酸激酶结构域上的ATP 结合位点，阻断由EGFR活化引起的一系列胞内级联酶促反应，阻止活化信号转导至核内；另一类是针对EGFR胞外部分的单克隆抗体，如西妥昔单抗，此类药物可与EGF、TGF等配体竞争EGFR分子上的特殊结合位点，阻断配体对受体的激动作用，并下调其在胞膜的表达水平，从而抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡。已有的研究显示西妥昔单抗对于EGFR高表达的结直肠癌、头颈癌、非小细胞肺癌等已有较为明确的疗效。

尽管EGFR及其靶向治疗对于鼻咽癌治疗意义和价值尚不十分明确，但是可以肯定，在各种病理类型的鼻咽癌组织和癌旁组织中均存在有EGFR的高表达[5-6]，提示EGFR 及其下游信号转导通路在鼻咽癌的发生发展过程中具有相当重要的意义，阻断EGFR及其信号通路对鼻咽癌可能具有一定的治疗作用。

我们的前期工作已证实，西妥昔单抗对人鼻咽癌细胞株CNE存在一定的增殖抑制作用[4]；同时，鉴于肿瘤的发生、发展不仅是细胞增殖失控的结果,也是细胞凋亡受限的结果，诱导肿瘤细胞凋亡也同样有着重要的肿瘤治疗学意义[7]。因此，本实验尝试了观察西妥昔单抗对鼻咽癌细胞的凋亡诱导效应。

Hochest 33258荧光法揭示了CNE细胞胞核染色质从聚集浓缩到裂解为碎块再到形成凋亡小体的典型凋亡形态学变化过程；透射电镜结果进一步证实CNE细胞经西妥昔单抗处理后存在超微结构的凋亡特征性改变； AnnexinV-PI双染流式细胞检测确证，经西妥昔单抗作用48 h后处于早期凋亡阶段的CNE细胞为(15.30±0.95)%，显著高于对照组(P<0.05)。提示西妥昔单抗体外可显著诱导人鼻咽癌细胞株CNE凋亡。

细胞凋亡不同于坏死，它涉及一系列蛋白的表达与调控，其中Bcl-2家族是最重要的凋亡相关蛋白之一。Bcl-2家族分为两类：凋亡抑制蛋白(如Bcl-2等)和凋亡诱导蛋白(如Bax等)，两类蛋白的相互作用，共同调节细胞是凋亡还是存活[8]。本实验显示西妥昔单抗作用CNE细胞48 h后Bax蛋白相对表达强度显著上调，Bcl-2蛋白的相对表达强度显著下调。由于Bax与Bcl-2相互作用可能还是以两者间的比值来决定细胞的生存与凋亡，因而，我们又比较了Bax与Bcl-2的比值，结果显示：西妥昔单抗组显著高于对照组(P<0.05)，并随浓度的增加而逐渐升高。提示西妥昔单抗可能是通过上调Bax、下调Bcl-2，进而上调Bax/Bcl-2比值来诱导CNE细胞凋亡的。鉴于细胞内信号传递途径十分复杂，更确切的作用机制尚待进一步研究。

总之，西妥昔单抗对人鼻咽癌细胞株CNE有显著的凋亡诱导作用，其机制可能是通过上调Bax并下调Bcl-2而实现，其确切机制还有待进一步探讨。

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