纳米技术在肝癌诊治的应用进展与技术前景

刘 辉， 李爱军， 周伟平

目前在肝癌治疗上存在的问题是：肝癌的诊断与预后分类是建立在临床症状与病理因素基础上的，不足以反映肝癌个体患者临床全部的动态过程，且不能够完全预测肝癌诊断与治疗效果[1-4]。临床绝大多数抗癌制剂仍不能够区分癌细胞与正常细胞，结果导致了系统性的毒性与严重副作用[5]。现有的肝癌探测与疗效评价方法存在严重缺陷。

纳米材料具有独特的声、光、电、热、磁、力学性能，为肝癌的预警与个性化治疗带来了新的机遇[6-8]。基于纳米粒子的早期肿瘤标志物检测技术，活体动态多模式影像诊断技术，以及纳米缓释药物、纳米药物支架与纳米药物递送器件已成为研究热点。美国、日本和欧盟等都集中多学科的力量，对这一问题开展综合、交叉研究，可行性已得到临床初步实验证实，纳米材料基础上的肝癌诊断治疗技术，有望成为攻克肝癌的有效手段[9，10]。我国在这方面的研究处于机遇与挑战并存的阶段。这里，介绍我国近5年来，肝癌纳米诊断治疗领域取得的重大进展，目的是引起临床与基础研究工作者的高度重视。

1 肝癌诊治新观点——癌的纳米分型,单细胞、单分子检测与个性化治疗

肝癌是多种基因参与、多阶段多途径协同作用的结果，也是一种分子信息疾病[11，12]。肝癌干细胞是肿瘤生长、侵袭、转移和复发的根源。由于早期诊断技术的发展，早期肿瘤患者的5年存活率上升为66.1%，但中晚期患者的5年存活率几乎没有提高[13]。临床上，早期诊断率每增加1%，全球就有约76万人免于死亡，中国约有16万人可获得新生。

分子谱的研究已经揭示分子信号与肝癌行为之间的关系，每个肿瘤患者的特异性分子图谱与预后密切相关，而且具有特征性。肝癌的浸润与转移表型能够用一套分子标志物来预测与表征，即“nanotyping”的肿瘤纳米分型概念[14]，这个独一无二的分子谱能够被用于预测肿瘤细胞的侵袭与转移潜能，在缺氧与代谢应激条件下肿瘤细胞生存与生长的能力，以及对抗宿主免疫反应而生存的能力[15，16]。因此，利用肿瘤的纳米分型谱，可以预测肿瘤的转移、对治疗的反应以及治疗效果。

近年研究表明，肿瘤发生早期，生物活性脂类分子代谢的异常可以从人的体液(血清/血浆)中直接检测到。例如，LPA(Lysophosphatidic Acid)被发现在肝癌的发生和发展中发挥作用，可以诱导上述多种癌细胞的增殖和迁移[19，20]。除LPA以外，S1P(Sphingosine-1-phosphate)和SPC(Sphingosylphosphorylcholine)也与肿瘤的发生、发展过程中血管的生成等有关[21-23]。建立生物活性脂类分子代谢与肿瘤发生之间的剂量效应关系，可为早期发现肿瘤提供新的手段。

对肿瘤患者的治疗必须考虑到患者的个体差异，只有根据患者独特的分子遗传信息，根据相应肿瘤干细胞的靶点来筛选治疗药物，制订综合性治疗方案，实行个性化治疗，才能提高患者生存的质量。纳米技术为单细胞、单分子的检测提供了支撑平台[24]。建立与肿瘤不同发展阶段密切相关的单个细胞的特征基因表达谱与蛋白质谱，实现肿瘤的纳米分型，实现活体单个细胞显像与动态追踪，实现显像诊断治疗一体化是肿瘤纳米诊断治疗技术的目标。

2 肝癌纳米诊断技术的进展

2.1 纳米粒子增强体外检测技术的灵敏度与特异性 肿瘤标志物的检测方法主要包括聚合酶链反应(PCR)与抗原抗体反应基础上的系列检测方法，这些方法存在敏感性与特异性方面的问题。利用纳米粒子的吸附、信号放大、催化以及特殊的荧光信号与增强光谱信号性能，把纳米粒子与传统检测方法结合起来，可以显著增强检测的灵敏度与特异性[25]。可喜的是我国学者崔大祥利用纳米碳管能显著增强PCR反应效率，量子点能显著增强PCR特异性[23]。利用磁性纳米粒子与金纳米粒子标记抗体，利用夹心法捕获抗原，利用金纳米粒子淬灭荧光分子特性，可实现血液中AFP定量检测。此法灵敏度与特异性显著优于ELISA诊断方法[26]。同时免疫量子点快速层析的检测试纸条与荧光磁性纳米粒子试纸条，可用于血液中肝癌标志物的快速检测，具有显著增强的灵敏度与特异性，利用金纳米棒高比表面积，建立的金纳米棒阵列与杂交检测方法，可把血清中肿瘤标志物的检测提高10 000倍的检测灵敏度[26]。 基于碳纳米管与量子点自组装原理的超敏感的DNA与抗原检测方法[27，28]被认为是一个重要的检测技术原理的进展。

2.2 纳米粒子增强拉曼光谱的检测范围 自从Nieshuming等在1997年报道单分子与单纳米粒子表面增强拉曼散射(SERS)以来[29]，一些组已经证实这种纳米粒子增强效率可达到1 014～1 015倍，导致拉曼散射穿越组织层，超过荧光有机染料。这种拉曼增强效应可以容许在室温下进行单个纳米粒子表面或2个粒子之间的单个分子的谱探测与识别。与荧光染料和量子点标记相比，表面增强的拉曼散射激活的粒子包含信号增强的内在机制，在室温下可提供丰富的谱信息[30]。这个发现为利用SERS作为单细胞与组织样本的多个生物标志物的谱标记打开了方便之门。初步研究表明，利用这种方法，可以100%区分出癌与邻近黏膜与远区黏膜，可以确定皮肤肿瘤实际范围。这种技术可以用于组织病理研究，在肿瘤显像与肿瘤分子谱研究方面，具有广阔的应用前景[31]。

2.3 多功能纳米粒子基础上的分子影像技术进展 2000年Piwnica Worms 于Orlando第48届放射科医师年会上明确提出“molecular imaging ”的概念。2001年Weissleder 详细介绍了分子影像学的定义并阐明与以往影像医学的异同以及分子影像学的优点、缺点、作用等。随后，掀起了一股研究热潮。迄今用于分子影像学的成像方式包括核医学同位素、核磁共振(MRI)、光学成像和超声等。其中，MRI无创伤、无电离辐射，有极好的软组织穿透力、很高的空间分辨力和软组织分辨力，能三维成像且图像直观，适用于临床并且方法简单，同时能行解剖和功能成像，已经成为分子影像学最重要的分支，但其缺点是敏感性较低，急需放大信号的造影剂，纳米磁性粒子探针的应用为解决此难题[32，33]带来了机遇。

以超顺磁氧化铁(SPIOs)和细小超顺磁性氧化铁(USPIOs)为代表的超顺磁性纳米粒子造影剂，造福了人类[34]。这些造影剂通过明显改变质子从激发态到基态的衰减时间，包括纵向弛豫时间(T1)和横向弛豫时间(T2)来提高MRI成像对病变的检出。但这些粒子由于没有分子靶向的特异性且驰豫信号较弱，均不能用于MRI分子影像。仅能用于肝转移癌、原发性肝癌、血管造影、淋巴造影等被动靶向MRI造影。但随着研究的深入，人们逐渐认识到上述分子探针仍存在严重的缺陷，特别是由于采用的共沉淀法合成的纳米氧化铁颗粒在粒子尺寸晶型控制上的不足，使得这些粒子还不能提供足够的信号对比强度[在粒子表面修饰的探针还不能实现体内作用的最佳特异性与最优的生物分布[35]。因此，新型纳米材料的制备与探针的表面修饰研究已成为分子影像探针新突破的关键。与传统的通过共沉淀法合成MRI标记粒子形成对比的是，近几年来超顺磁纳米粒子的合成技术有了重大的突破，特别是高温溶剂前驱体分解法已能合成出晶型十分完整、尺寸高度一致的粒子[36]。Jin-Suck Suh等2007年1月在Nature Medicine公布的研究结果进一步证实这种新型的纳米粒子具有比传统共沉淀法合成的粒子强得多的T2信号对比,显示作为MRI分子影像标记探针的巨大潜力。

2.4 量子点基础上的分子显像技术进展 荧光量子点(又称纳米晶体)是另一类重要的有望应用于光学分子影像的纳米材料。荧光量子点是一类非常重要的功能纳米材料，其直径约为1～10 nm。由于尺度量子效应，它们表现出独特的光致发光性能。主要表现为：发射波长范围窄，斯托克斯(Stocks)位移大，量子产率高，荧光寿命长，化学和光学稳定性好[37]。由于吸收光谱重叠范围宽，可采用单一波长的激光为激发光源，实现多色标记，特别适合于活体细胞成像和多组分同时检测。研究发现这种荧光探针与最灵敏的有机荧光染料罗丹明(Rhodamin) 相比荧光强度提高20倍，漂白速率降低100倍，荧光光谱宽度减小3倍。目前荧光量子点已用于免疫分析、基因分析、活体及细胞荧光成像等领域，可能为某些肿瘤的早期诊断提供一种新型分子诊断手段。同时，它们可以作为一种新型的光敏化试剂用于某些肿瘤光动力学治疗[38]。我国成功地制备了具有良好生物相容性的磁性荧光量子点复合纳米材料，荧光磁性多功能纳米材料，还在表面进一步联接了肿瘤单链抗体，成功实现肿瘤靶显像治疗一体化[39]。

2.5 纳米粒子基础上超声成像诊断技术进展 包含气体分子纳米颗粒基础上的超声成像与治疗一体化技术快速发展[40]。这种方法成本低，方便，非侵入体内，在优越的造影剂条件下，能够对癌组织的功能、结构、分子方面的特征进行综合评估。缺氧微环境与肿瘤起始血管形成能够造成癌细胞在早期改变局部血管并产生一些代谢产物，如血管灌注与氧化方面存在差异等生理改变[41]。利用这些差异，可以实现肿瘤诊断治疗。

微气泡(microbubble)是美国FDA批准的造影剂，主要用于心功能评估。目前，微气泡与纳气泡(nanobubble)已经被用作人体癌组织与动物肿瘤模型超声的造影剂。微气泡主要由聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸[poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA)]、蛋白质、几丁质与脂质组成。也可以把药物或低溶解度的惰性气体填充到气泡中，增强在体内循环时间。目前研究表明，微气泡与纳气泡的生物安全性与生物兼容性都非常好，是多种模式成像、动态成像系统的后选造影剂。美国Ohio State University合作伙伴Ronald Xu教授研究表明，把靛青绿ICG(Indocyanine green)包裹进微气泡与纳气泡，可以动态显出肿瘤图像。这些进展为进一步研发多种模式分子影像技术奠定了基础[42]。

多模式成像(multimodality imaging)是现代医学影像学发展的方向，通过复合2种以上的成像技术，可获得更完整的生物信息，对疾病可做出更准确的诊断，目前以PET/CT为例的多模式成像在许多领域里发挥着重要的作用。能同步用于肿瘤结构和功能成像的多模式学成像在美国等发达国家尚处于起步阶段，国内更是空白[43-45]。

现有的肿瘤氧合作用的检测技术包括血氧水平依赖性(BOLD)MRI、电子顺磁共振(EPR)、极谱氧电极法、荧光猝灭法、磷光猝灭法等。然而，由于这些技术内在的局限性如空间分辨率低、诊断特异性差、可重复性不高，使得它们在临床上难以推广。近红外漫射光学成像和光谱学分析(NIR-DOIS)有望提高检测的空间分辨率和敏感性。另外600～900 nm之间的近红外光对生物组织有很强的穿透性，可达到10 cm，能对深部的肿瘤组织进行成像和断层扫描[46，47]。

ICG封包聚乳酸-乙醇酸(PLGA)微球是一种新型的纳米材料，具有体内停留时间长、无毒、良好的生物相容性以及装载药物能力，且能同时为结构成像模式(如超声)和功能成像模式(如NIR)提供增强对比，有望成为多模式动态成像的最理想的对比剂[48]。聚乙烯二醇修饰的金纳米颗粒是另一个有广泛应用前景的对比剂，除了生物相容性和安全性外，它的光强度是半导体量子点的200倍，能检测出很微弱的生物信号[49-51]。氧化铁合成的MNPs磁性纳米颗粒因为能对深部组织成像，也引起了大家广泛的关注。

3 肿瘤纳米治疗技术的进展

纳米科技与现代肿瘤的研究成果结合起来，为肿瘤个性化治疗提供了新的机遇与发展空间。近5年来，肿瘤纳米治疗领域出现一些独特、高效的治疗方法。特别是随着纳米探针的设计与微纳加工技术手段的进步，肿瘤显像诊断治疗一体化已成为一个新的研究热点。针对肿瘤缺氧与肿瘤血管、肿瘤干细胞靶分子设计纳米靶向探针，结合纳米粒子的特殊效应如磁性粒子热效应、碳纳米管与金纳米棒吸收近红外热效应、纳米靶向缓释效应等进行多功能纳米靶向治疗已成为一个重要发展方向[52，53]。传统的基因治疗与细胞免疫治疗，包括反义治疗核酸、小干涉RNA、microRNA等与高效纳米递送载体结合起来，显著增强了治疗效果[54]，展示出诱人的技术前景。

3.1 磁性纳米粒子基础上的肿瘤显像治疗一体化 纳米磁性粒子具有超顺磁特性与高的磁饱和度，可受体外磁场操控。如磁性纳米粒子已成功用于核磁共振造影剂，用于血液干细胞、细胞中的核酸与蛋白质的分离。纳米Fe3O4粒子表面可进行改性，可随带治疗核酸或蛋白，进入肿瘤细胞，结合外在磁场，利用磁球的热效应，可快速杀灭肿瘤细胞[55]。如制备的超顺磁性氧化铁超微颗粒脂质体，能够发现直径3 mm以下的肝肿瘤,这对肝癌的早期诊断有着十分重要的意义。已完成的磁性粒子介导的肝癌治疗研究，显示出比传统的热疗具有明显的优势。阿霉素包裹的磁纳米粒子运用到晚期肝癌治疗，不仅大大提高了疗效，而且较好地降低了毒副作用[56，57]。我国学者首次报道树形分子修饰的磁性纳米粒子显著增强基因递送效率。随着树形分子的代数增加，树形分子可随带的基因或药物也成倍增加，而且由于电荷作用，随带的基因或药物的树形分子被压缩到磁性纳米粒子表面，由于带正电荷能够与细胞膜结合，并诱导肿瘤细胞高效内吞。第5代树形分子修饰的磁性纳米粒子随带survivin反义核酸，可以在15 min内高效进入肿瘤细胞，并能释放出survivin反义核酸，展示出显著的抑制肿瘤生长的功能。在外加磁场作用下，可显著增强杀伤肿瘤细胞的协同功能，同时并不损伤正常细胞，更重要的是能够利用核磁共振实现肿瘤细胞示踪功能[58]。

3.2 荧光碳纳米管基础上的肿瘤靶向治疗 碳纳米管，由于具有独特的力学、物理与化学性能，作为一类高硬度、稳定与中空的一维纳米材料，在肿瘤的治疗方面具有广泛的应用前景。碳纳米管能够被核酸或蛋白质填充，表面也能够被修饰，带上治疗核酸或蛋白质等靶分子，快速进入细胞浆与细胞核，达到治疗疾病的目的[59]。例如，链亲和素桥连的单壁碳纳米管能够经内吞途径进入人的白血病细胞与T淋巴细胞，实现肿瘤治疗功能[60]。

最近2年，荧光碳纳米管被成功制备，既可载药，又可成像，为肿瘤的显像治疗提供了一种新手段。荧光碳纳米管，由于是长条管状结构，像纳米弹簧一样，以非能量依赖方式高效自由地进出细胞，由于中空结构，可以随带治疗药物进入肿瘤细胞，在细胞内环境中的各种离子的作用下，能够从孔中释放出来，发挥治疗作用。由于碳纳米管在近红外区域具有吸收光而产热的特性，在体外红外线照射下，能够特异性杀灭肿瘤细胞，同时也增强治疗药物的协同效应[50]。利用荧光信号，可以实现对肿瘤细胞的示踪，科学评价治疗效果。

3.3 金纳米棒基础上的光热效应 金纳米棒作为一种贵金属材料，由于在肿瘤的光热治疗、生物传感、分子影像与基因递送方面独特的性质而吸引了相当大的注意。金纳米棒具有两个吸收峰，一个位于可见光520 nm区域，另一个位于800 nm近红外区域[61]。由于生物组织在近红外区域是相对透明的，近红外光能够穿透进入深部组织，这为利用金纳米棒吸收近红外光而产热破坏肿瘤细胞提供了理论依据。El-Sayed等把金纳米棒与抗EGFR单克隆抗体连接起来，高效进入肿瘤细胞，在近红外光辐射后，可杀死肿瘤细胞[62]。类似的报道也证实叶酸桥连的金纳米棒在近红外光辐射后，可以破坏肿瘤细胞膜的完整性，导致肿瘤死亡。我国利用树形分子修饰的金纳米棒随带光敏剂与抗癌药物及单克隆抗体，既可以直接靶向肝癌组织，又可以在体外近红外激光照射下，对肿瘤局部组织实行光动力学治疗与抗癌药物协同治疗[63]。这种消灭肿瘤细胞的方法与传统的热疗是两个概念。金纳米棒基础上的光热治疗为肝脏肿瘤的治疗打开了一条新路。

3.4 纳米药物与纳米药物递送系统 纳米药物实际上是纳米复合材料，或称纳米组装体系，是以纳米颗粒及它们组成的纳米丝、管和囊为基本单元在一维、二维和三维空间组装排列成具有纳米结构的体系，是按照人的意志组装合成的纳米结构系统。纳米药物具有很多优点，如：稳定性好、对胃肠刺激小、毒副作用小、药物利用度高，可靶向给药与透皮给药，具有缓释作用。纳米药物还包括药物的纳米化加工技术。药物纳米化的主要优势是：通过减小粒径、控制粒径分布来提高药物的溶解性，使药物易吸收；延长药物的体内半衰期，靶向与定位给药；根据具体用药情况，具有易于透皮吸收、易于穿过血脑屏障等优点。例如，采用一种聚合胶囊包裹治疗肿瘤的药物，胶囊中混合有纳米金粒子，同时组装了肿瘤细胞的抗体，当这种微型胶囊注入血管后，它们就会主动聚集在肿瘤内部，一旦数量足够，医务人员就可以在患者体外用近红外激光束激射这些胶囊，当胶囊外壳熔化后，内部的药物就会被释放出来，杀死肿瘤细胞，同时最小化对附近组织的损伤，显著提高了疗效。脂质体是一种常见的药物递送载体，具有的优势是：缓释，生物降解，好的生物兼容性与药物靶向性。最近几年，一种新型脂质体，即乙醇脂质体具有非常强的透皮能力，能够随带5-FU药物透过皮肤直接进入皮下组织血管。我国学者魏于全教授、陈俐娟教授、钱志勇教授等人在和厚朴酚的新剂型，包括纳米药物、可注射水凝胶制剂等方面进行了大量的研究工作[64-66]，并探讨了和厚朴酚新型制剂在肿瘤治疗、放化疗增敏中的应用[67-69]，使药物进入肿瘤内部，实现靶向缓释治疗。这为药物进入体内提供了另外一条通路。

4 基于聚合物材料的微纳加工技术为研制药物递送器件提供了新平台

聚合物微球在药物递送与生物活性复合物制备中获得广泛应用。例如，它们被注射进入人体，用于长期药物释放；也可通过呼吸道把药物吸入肺部，用于肝癌等肿瘤的化疗；也可作为口服疫苗，进入胃肠道；也可用于眼睛，克服药物体内快速消除。总之，聚合物可用于生物活性成分的保护，增强生物利用度。大量的方法如喷雾干燥、乳液溶剂蒸发、相分离、碾磨已经被用于聚合物微球制备，但是，仍有体积不能控制、球形或不规则形状、单一对称性或核壳结构等。为了研发多功能、智能化的下一代药物递送装置，必须发展新的加工技术。

微制造技术已经被用于制造颗粒形的药物递送装置，可以控制形态、大小、甚至制备出不对称结构，提供了吸引人的特征[70，71]。

另外，很多低成本的技术已经或正在发展。与基于硅的微制造技术相比，它们在材料选择、处理过程方面更具有方便性。软蚀刻(Soft Lithography)是一组利用带有微纳结构特征的人造图章来制造微纳装置的技术。包括McrioContact Printing, MicroTransfer Molding[72]，microFluid Contact Printing这些技术。在一个牺牲层上印刷，可以获得微纳结构。Derk J.Hansford教授已经发展了新技术，可以广泛用于具有缓释药物递送装置的制造[73，74]。日本早稻田大学生命工学研究所Yi Qian教授，在药物支架等制造方面，有20多年的经验积累。所有这些，为我们可控制备粒径均一、包药的、具有缓释功能的纳米药物及递送装置奠定了基础。

5 面临的挑战与前景

纳米科技为肝癌等肿瘤的早期探测、活体内肿瘤显像、个性化诊断与靶向治疗提供了新的机遇与发展空间。纳米技术作为一个高新技术手段，为肿瘤的基础研究，细胞信号网络、细胞内转运、涉及肿瘤发生发展与转移的基因调控的研究提供了强有力的工具与手段。特别是纳米生物材料、药物和转基因纳米载体、纳米生物相容性人工器官、纳米生物传感器和纳米成像技术、利用扫描探针显微镜分析蛋白质和DNA的结构与功能以及微型智能化医疗器械等，已成为研究开发的焦点。

利用肿瘤干细胞的靶点及其特异的分子信号通路来设计治疗纳米探针，结合纳米材料特性，进行肿瘤干细胞示踪与捕获杀灭，应该是一个新的研究方向和治疗策略，为攻克肿瘤转移、复发展示出诱人的美好前景。但是，如何科学合理地应用纳米科技，造福人类，也面临着新的挑战。

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