Mg-1Zn-0.3Zr-2Gd-1Ca合金作为骨内固定材料在大鼠骨质疏松性骨折愈合中的研究

王战会，李亚伟，刘少朋，张兵兵，郑秋霞，谷留平

骨质疏松性骨折是一种常见的疾病，其内固定治疗的材料主要有生物医用高分子材料、生物医用无机非金属材料及生物医用金属材料。在金属材料中，目前以镁合金应用较多，但其自身的弹性模量远高于骨组织的弹性模量，在应力屏蔽的基础上易引发再骨折[1]。再者，镁合金在体内腐蚀速率快，易引发应力腐蚀断裂(stress corrosion cracking, SCC)[2]，严重影响其应用范围。而添加其他金属可有效改善其特性，Zn、Ca便是其中常用元素[3-4]。此外，在镁合金表面添加涂层也可延缓其降解速率，壳聚糖即是其中之一，它不仅可增加镁合金可塑性，还具有抗菌性[10]。基于此，在总结已有研究成果的基础上，本研究通过制备含有壳聚糖涂层的Mg-1Zn-0.3Zr-2Gd-1Ca合金，并研究其在大鼠体内的生物相容性等特点，以期寻找一种更加符合骨折临床应用的可降解材料。现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料试样制备及研究：Mg、Zn、Zr、Gd、Ca元素(河南科技大学材料学院)；真空熔炼电阻炉(ZG-10，株洲鼎鑫电热设备有限公司)；Quanta 200型扫描电镜(西门子)；X线C臂机(飞利浦)；镁离子检测试剂盒(WAK-Mg，南京建成生物工程研究所)；钙离子检测试剂盒(K380-250-1，南京建成生物工程)；肝功能生化检测试剂盒(上海透景生命科技股份有限公司)；肾功能生化检测试剂盒(7170瓶型，上海透景生命科技股份有限公司)。动物实验材料：成年雌性大白鼠(西安迪乐普公司)。

1.2方法

1.2.1壳聚糖镁钙合金的制备采用真空熔炼电阻炉制备Mg-1Zn-0.3Zr-2Gd-1Ca合金。①针对不同比例设定不同烧损量，配置成实验所需Mg-1Zn-0.3Zr-2Gd-1Ca合金，在氩气保护下置入钨坩埚中充分溶解，480 ℃保温20 min，用石墨棒搅拌使金属元素充分混合；此后精炼、扒渣并静置处理，在真空熔炼电阻炉中将420 ℃的镁合金溶液浇筑到预热200 ℃的铁坩埚中，静置30 min后脱模，获得铸造态试样。②将试室温2 h内升至300 ℃，恒温保持3 h；再缓慢升温2 h至510 ℃保温20 h，随后60 ℃热水淬火。③人工时效处理：将所得固溶体从室温加热至150 ℃，保温26 h，随炉冷却。④壳聚糖涂层制备：80%磷酸预处理合金表面2 min，自然晾干；将脱乙酰度90%，分子量为3×105的壳聚糖溶解于1%醋酸溶液中，制备成质量分数为1%的壳聚糖醋酸溶液，将100 μL壳聚糖醋酸溶液均匀涂抹于处理过的镁合金正反两面；将其放入60 ℃烘箱中干燥30 min。⑤切割、抛光：祛除试样表面氧化层，将其切割成1.0 cm×0.5 cm×3.0 cm大小；先水磨砂纸粗磨，再采用金刚石抛光膏行机械抛光，直至试样表面无粗磨痕迹，再在鹿皮上进行精抛，制成所需成品。

1.2.2实验动物分组取27只健康成年雌性大白鼠，体质量(0.3±0.1) kg，同等条件下[恒温(23±0.5) ℃，恒湿45%～50%]饲养4周后分别切除卵巢，建立骨质疏松模型。待恢复良好后随机等分为普通镁钙合金组(A组)、壳聚糖涂层镁钙合金组(B组)、假手术组(C组)，每组各9只。

1.2.3手术方法使用戊巴比妥钠(30 mg·kg-1)经耳缘静脉实施麻醉，取右股骨中段手术区常规备皮、消毒、铺无菌单，依次切开皮肤、皮下组织、筋膜，分离肌肉组织，暴露股骨，医用电钻于股骨表面钻孔后于两孔间制作10 mm×2 mm骨缺损，模拟骨折断面，将合金试样置于骨缺损间，并固定良好，见图1。其中假手术组仅制造骨折断面，未放置合金材料，空白对照组未做特殊处理。术毕，过氧化氢及无菌生理盐水冲洗术野并逐层缝合。

图1 术中固定合金试样

1.2.4术后处理措施及观察指标标签分别注明手术时间、合金类型。术后动物自由活动，分笼常规饲养。术后1周连续肌注庆大霉素每日40万U，预防感染。分别于术后7、14、21 d分批(每次3只)随机处死各组大鼠并取出合金组织，以备后续研究。观察各组大鼠术后精神状态，活动、饮食状况、伤口愈合情况。对所取材料行扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)观察了解合金降解情况。术后不同时间化验各组鼠肝功能(谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶)；肾功能血清尿素氮(serum urea nitrogen,BUN)；肌酐(creatinine,Cre)；尿酸了解合金的生物学毒性，并检测血清中镁离子、钙离子浓度。

2 结果

2.1术后一般情况各组大鼠术后生命体征平稳，精神状态、进食状况未受明显影响。A、B组大鼠术后肢体活动正常，C组大鼠术后右下肢功能短期内受明显影响。观察期内均未发生切口感染、皮下气肿，亦无死亡事件发生。

2.2术后扫描电镜观察SEM检测示，术后7 d时，A组试样表面片状腐蚀明显，局部腐蚀产物脱落，B组植入物表面可见腐蚀产物聚集，但整体完整。术后14 d时，A组试样腐蚀进一步加重，且不均匀，表面凸凹不平，结构缺损明显，可见大量裂纹产生，但B组试样表面仅见少量浅裂纹，且结构完整。术后21 d时，A组试样结构破坏明显，裂纹加深且宽大，而B组试样表面裂纹虽有增多，但仍较A组明显偏少，且整体结构完好，见图2。

2.3生物学毒性检测

2.3.1手术前后各组大鼠血清镁离子、钙离子浓度变化情况术前1 d A、B、C组大鼠血清镁离子浓度

分别为(1.23±0.23) mol·L-1、(1.19±0.51) mol·L-1、(1.22±0.10) mol·L-1、(1.18±0.47) mol·L-1。术后A、B组2周内镁离子浓度增高，且以A组变化更明显，两组均在3周时降至正常，但术前、术后各时间点镁离子变化无统计学意义(P>0.05)，各组间差异亦无统计学意义(P>0.05)。钙离子浓度变化与此类似，见图3。

A组：普通镁钙合金组；B组：壳聚糖涂层镁钙合金组。图2 术后不同时间两组合金试样表面腐蚀情况(SEM，×200)

图3 手术前后不同时间各组大鼠血清镁离子、钙离子浓度变化(n=27)

2.3.2手术前后各组鼠外周血肝、肾功能变化情况术后A、B、C组转氨酶较前稍升高，此后逐渐降至正常，但术前、术后各时间点肝功能各指标变化组内差异无统计学意义(P>0.05)，各组间差异亦无统计学意义(P>0.05)。肾功能各指标变化亦如此，见图4。

3 讨论

骨质疏松症(osteoporosis, OP)是一种由多因素作用的疾病，其病机尚未完全明确，但由其引发的骨折却极大地危害着人体健康。近年来，不断完善的骨折内固定材料广泛应用于骨折治疗，但部分骨折内固定材料因生物相容性差、力学性能欠佳、排斥反应大等缺陷，而使其适用性受限[5-6]。此后，更多学者尝试不断完善镁合金的相关研究，将Al、Mn等多种元素加入其中，并取得一定效果，但仍不能完全避免其降解速率快、体内产气多的缺陷[7-8]。目前有报道试图通过在镁合金表面添加涂层的方法延缓其降解速率，而壳聚糖便是其中之一[9]。壳聚糖是目前发现的唯一碱性氨基多糖，其结构经过一定修饰后可得到具有良好抗菌性、生物相容性、可塑性及无毒性特点的材料，进而被应用于骨折内固定[10]。基于以上因素，并结合国内外相关研究，作者制作出含有壳聚糖涂层的Mg-1Zn-0.3Zr-2Gd-1Ca合金，并探究其在动物体内的生物相容性，以期为后续研究提供一定参考。

本研究中，各组鼠术后恢复顺利，未出现切口感染、皮下气肿等相关并发症，植入物与鼠体内组织保持良好相容性，这与Kim的报道类似[11]。Seitz等[12]研究发现，未添加涂层的普通镁钙合金在体内降解速率快而难以在骨折内固定中达到良好效果。本研究中术后7 d时，A组合金表面出现明显的片状腐蚀区，局部腐蚀产物脱落，而B组整体结构完整。术后14 d时，A组试样腐蚀进一步加重，且不均匀，表面凸凹不平，结构缺损明显，可见大量裂纹产生，但B组合金因含有壳聚糖涂层，降解速率较慢，仅见少量裂纹，且深度较浅。至术后21 d时，A组试样结构破坏明显，裂纹宽大且深，但B组仍保持较为完整的结构。这提示壳聚糖镁钙合金较普通镁钙合金降解速率慢，更接近骨折愈合过程，显示出良好的生物相容性。两组相比较，术后相同时间内，普通镁钙合金表面由点腐蚀较快变为面腐蚀，腐蚀速率显著高于壳聚糖涂层组，作者预测壳聚糖涂层在降解过程中可能起到了保护膜作用，进而延缓了镁钙合金的降解[13]。

在关于生物学毒性的检测中，术后各组鼠不同时间虽然转氨酶都有不同程度的增高，但均在可控范围，且随着术后时间的延长，各组鼠转氨酶均逐渐降至正常范围，未对术后鼠的恢复造成明显影响。手术前后各组鼠肝功能各项指标变化均无统计学意义，肾功能指标变化情况与肝功能相类似，这与姜冬梅的研究结果一致[14]。在离子浓度检测中，术后虽然A、B组血清镁、钙离子在2周内有所升高，且以A组变化明显，但各组鼠均为轻微升高，此后均逐渐降至正常，并未出现高血镁或高血钙等并发症，说明镁、钙离子浓度的变化均在实验鼠可承受范围内，并未对鼠的术后恢复造成明显影响。这提示镁钙合金的降解是安全的，降解后产生的镁、钙离子可及时被机体代谢，初步展现出良好的生物相容性，这与目前已有研究结果相一致[15-18]。此外，手术前后各组鼠血清镁离子变化无统计学意义，结合本研究中术后扫描电镜的研究结果，虽然普通镁钙合金相较于壳聚糖涂层的镁钙合金降解速率快，但两者的降解产物均未对大鼠正常的机体内环境及电解质水平造成明显影响，生物毒性小，安全性较高。

综上所述，作者设计的Mg-1Zn-0.3Zr-2Gd-1Ca合金具有良好的生物相容性，安全性高，添加壳聚糖涂层后延缓了其降解速率，初步展现出一定的临床应用价值。但本研究观察周期短、实验样本少，尤其是在此合金降解后产物成分及量的分析，术后不同时间合金对实验动物心脏、肝脏、肾脏等脏器的影响等方面，仍需更加微观细致的长期研究。