定量荧光PCR筛查Y染色体AZF微缺失

杨 曦，黄伟伟，卢 建

目前全世界大约有15%的夫妇不育，其中男性不育约占50%[1]。引起男性不育的因素有很多，非遗传因素的有隐睾、精索静脉曲张、输精管阻塞、生殖系统感染、内分泌紊乱等[2]。由遗传缺陷引起的精子发育障碍约占男性不育的30%，遗传因素的有克氏综合征性、Y染色体微缺失等，Y染色体微缺失是除了克氏综合征导致男性特发性不育的第二大遗传因素[3-4]。Y染色体微缺失是由于Y染色体上的精子生成基因(azoospermia factor,AZF)发生了微缺失，AZF基因与精子生成有关分，其存在互不重叠的3个区域，即AZFa、AZFb和AZFc[1]。本文应用多重定量荧光PCR(quantitative fluorescent PCR,QF-PCR)毛细管电泳法[3,5]，对无精子症和少精子症的患者中进行Y 染色体AZF微缺失常规筛查，现报道如下。

1 资料与方法

1.1临床资料选择2015年1月至12月于广东省妇幼保健院就诊的精子发生障碍男性不育患者647例，年龄(32.8±6.1) 岁。按照WHO精液分析标准确诊为无精症120例、严重少精60例、少精症467例,使用EDTA·K2真空采血管抽取静脉血2 mL。WHO精液分析标准：3次检查精子密度，且精液离心后也未能发现精子为无精; 精子密度<5×106·mL-1为严重少精；精子密度<15×106·mL-1为少精。

1.2实验方法

1.2.1基因组DNA提取使用达安基因公司的Smart 32核酸提取仪，广州美基生物公司的磁珠提取试剂盒进行外周血DNA提取，严格按照试剂盒说明书进行。使用NanoDrop 2000 进行DNA浓度检测。

1.2.2PCR扩增PCR引物使用欧洲男科协会/欧洲分子遗传质量协作网(European Academy of Andrology/European Molecular Genetics Quality Network,EAA/EMQN)推荐的序列位置标签(sequence tagged site,STS)[6]，每个AZF区域使用2个STS序列，AZFa：SY84、SY86，AZFb：SY127、SY134，AZFc：SY254、SY255，以SRY(SY14)和 ZFAX/Y位点为内对照，PCR引物末端FAM、JOE和TAMRA荧光基团标记。扩增体系为PCR Mix 12.5 μL,引物混合物[3]2.5 μL,模板DNA 3 μL，灭菌水7 μL，总体积25 μL。扩增条件：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，54 ℃，30 s，72 ℃，60 s，共28个循环；60 ℃,60 min。设置2个对照：空白水对照、正常男性对照。

1.2.3PCR产物毛细管电泳检测在96孔板中加入上样体系，包括去离子甲酰胺9 μL，LIZ-500分子内标 0.5 μL，标记 PCR产物 1 μL, 总体积 10.5 μL。 在95 ℃下加热变性4 min，然后立即冰上放置 3 min，短暂离心后将96孔板放入ABI 3 500×L测序仪进行毛细管电泳检测，用GeneMaker(version2.2.0)软件对毛细管电泳结果进行数据分析。

2 结果

Y染色体AZF微缺失检测的649例患者中，检测出Y染色体AZF缺失17 例，缺失率为2.63% (17/647) ，如表1所示。其中AZFa缺失仅1例，AZFc缺失14例，AZFb、AZFc双重缺失2例。图1为正常男性的毛细管电泳结果，从图中可以看出SRY、ZFAX/Y内对照出现了峰，AZF基因3个区域对应6个STS对都出现了峰，说明AZF基因没有出现微缺失。图2为AZFc缺失患者毛细管电泳结果，从图中可以看出AZFc区域对应的2个STS没有峰出现，说明AZFc区域出现微缺失。

表1 Y染色体AZF缺失病例总数

图1 GeneMaker软件分析正常男性AZF微缺失检测结果

图2 GeneMaker软件分析AZFc微缺失患者检测结果

3 讨论

Y染色体AZF区域有编码精子生成基因，其缺失导致男性生精功能异常，与男性不育密切相关，男性因素所致不孕患者中AZF微缺失率1.3%～14%[7]。AZF通常分AZFa、AZFb、AZFc 3个不同亚区。

AZFa的缺失较少见，约占Y染色体微缺失的1%～5%，本文仅检测出1例AZFa缺失，AZFa缺失的患者最为严重，通常表现为唯支持细胞综合征(sertoli cell only syndrome,SCOS)，临床表现为无精子症[8]。AZFb基因缺失的患者表现为生精阻滞，主要停留在精母细胞或精子细胞阶段，睾丸内可见精原细胞和初级精母细胞，但无精子生成；如果同时伴有AZFa或AZFc的缺失，则表现为SCOS或生精阻滞[9]。Y染色体微缺失较为常见AZFc缺失[10]，本研究中共检测出16例AZcF缺失，14例AZFc单独缺失，2例为AZFb、AZFc双重缺失。AZFc缺失的患者其精子数目有进行性下降的趋势，临床表现多种多样，可无精子症或严重少精子症患者，也可表现为精子计数正常但伴有精子形态异常[2,8]。AZFa、AZFb完全缺失临床表现较为严重，由于患者行睾丸穿刺也不能获得精子，因此对于该类患者也没有必要做单精子细胞质内注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)，只能通过他人供精的方式生育后代。一般单独AZFc缺失患者尚有精子生成能力，可以做ICSI，但是会将AZFc缺失遗传给男性后代，女性后代不孕的风险通常不会增加，患者可以进行胚胎移植前基因诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)，选择女胚进行移植[10-11]。

EAA/EMQN发布的Y染色体微缺失的检测指南，推荐检测分别位于AZFa、AZFb 和 AZFc 3个区域的sY84、sY86、sY127、sY134、sY254和sY255 6个STS位点，即每个区域2个STS 位点。以SRY(SY14)和ZFX/Y位点为内对照，SRY是Y染色体特有基因，ZFX/Y在X/Y染色体上都存在。本文中的PCR扩增引物序列为这8个STS位点[3,5]。

目前临床上用于Y 染色体微缺失的检测方法很多，有实时荧光PCR、基因芯片、多重 PCR电泳、QF-PCR等。实时荧光PCR操作简单可以实现边扩增边检测，灵敏度高，有一定的假阳性；另外荧光PCR仪一般只有4～5种荧光信号通道，一次只能检测4～5个指标，所以对于8个STS位点需要分2个PCR管扩增检测[1]。基因芯片法PCR扩增完成后需要对PCR产物进行杂交，操作较电泳法麻烦、费时间。国内多数实验室主要使用多重PCR电泳进行检测，仅需普通PCR仪和琼脂糖电泳设备即可，但由于琼脂糖电泳不能区分相近的大小DNA片段，另外显色灵敏度也底，需要将引物分多组分别进行PCR扩增、电泳才能进行Y染色体微缺失检测[9]。而QF-PCR法需要对扩增引物进行荧光标记，由于荧光信号灵敏度较高，毛细管电泳DNA片段大小分度辨高，一管多重PCR扩增可以实现多个STS位点检测，操作简便，结果容易判读，但需要测序仪，可能限制其在临床的推广[3]。

Y染色体微缺失的检测，可以为部分原因不明的无精症或少精症患者从分子水平上明确病因，为临床医师的诊疗提供临床依据；避免患者不恰当的治疗，减少患者经济负担，为临床辅助生殖和遗传咨询提供指导。

参考文献：

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