VEGF、MMP-2在肝细胞癌组织中的表达与意义

王胐胐，李世朋，赵建龙，李文雅，丁雪贞，席守民

近些年来血管内皮生长因子VEGF在肝细胞癌血管生成和进展中的作用被广泛研究[1]。基质金属蛋白酶MMP-2可以参与细胞外基质(ECM)的降解和血管的发生，被认为在恶性肿瘤的浸润转移中发挥重要的作用[2]。本文采用免疫组织化学法检测VEGF、MMP-2在肝细胞癌组织中表达及两者的相关性，为肝细胞癌浸润转移的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1组织标本收集解放军150中心医院2007年6月～2011年8月接受肝细胞癌手术治疗患者术后存档的石蜡标本32例与正常肝脏存档石蜡标本19例，所有病例均有完整临床资料。

1.2主要试剂一抗兔抗人VEGF(美国BIOSS生产)和兔抗人MMP-2(美国BIOSS生产)，二步法免疫组化试剂盒(SP-0023)产自美国ZYMED公司，均购自北京博奥森生物技术有限公司；DAB显色试剂盒(AR-0612)购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.3方法采用免疫组化并严格按照二步法免疫组化试剂盒操作说明书进行染色。每例蜡块4 μm 厚连续切片3张,其中1张进行HE 染色,另2张进行免疫组化染色。一抗体工作液浓度均为 1∶150。石蜡切片常规脱蜡、水化,微波炉抗原热修复, 加封闭血清，最后进行DAB 液显色, 显微镜下控制，自来水冲洗终止反应, 苏木素复染2 min, 盐酸乙醇分化，自来水冲洗，然后梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4结果判断标准用试剂盒中的阳性片作为阳性对照，PBS取代一抗作为阴性对照。细胞膜或胞浆染色呈棕黄色视为阳性，采用半定量积分法依据染色强度和阳性细胞百分率判断染色结果[3]。

1.5统计学分析应用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。样本率的比较采用χ2检验，相关性分析采用 Spearman 相关检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

VEGF、MMP-2染色主要存在于细胞浆，细胞膜亦有部分染色。VEGF在肝细胞癌组织中的表达明显高于肝脏正常组织，差异具有显著性(P<0.05)，见表1。MMP-2在肝细胞癌组织中的阳性率显著高于正常肝组织，差异具有显著性(P<0.05)，见表2。采用配对资料的检验计算相关系数r=0.497，P<0.05，表明两种蛋白在肝细胞癌中的表达存在高度相关性，见表3。

表1 VEGF在不同肝脏组织中的表达

表2 MMP-2在不同肝脏组织中的表达

表3 VEGF与MMP-2在肝细胞癌中表达的相互关系

3 讨论

恶性肿瘤的生长、浸润和转移依赖于肿瘤间质血管生成，VEGF能通过旁分泌形式特异性作用于血管内皮细胞，通过促进内皮细胞增殖，增加血管通透性，以诱导肿瘤血管生成，在肿瘤的发生发展中起关键作用[4-5]。Park等[6]发现在正常肝细胞和肝细胞癌细胞中都有VEGF的表达，而且随着肝细胞癌组织血管形成的逐步发展，VEGF的表达程度也逐渐增加。本文通过采用免疫组织化学法检测肝细胞癌组织和正常肝脏组织中VEGF的表达，结果VEGF在肝细胞癌组织中的表达显然高于正常肝脏组织，说明本研究结果与Park等人的相符。因此表明血管内皮生长因子是一种增加血管通透性并促进新血管生长的细胞因子，在肝细胞癌组织中呈高表达并与侵袭转移和预后等生物学行为关系密切，与肿瘤及肿瘤转移灶的生长中的血管生成有关[7]。

ECM是肿瘤转移的主要屏障，而金属蛋白酶MMPs是降解ECM最重要的酶类。MMPs主要由成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞、巨噬细胞、中性粒细胞及肿瘤细胞合成和分泌，广泛分布于人体各组织。基质金属蛋白酶是一个依赖锌离子的肽链内切酶基因家族，研究发现MMPs活性上调与肿瘤侵袭、转移有关[8]。目前已发现多种，其中MMP-2可降解Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原、明胶等多种底物，其在肿瘤发生发展及侵袭过程中起着非常重要的作用。本文通过免疫组化方法对32例肝细胞癌组织和19例正常组织MMP-2表达发现，MMP-2的阳性产物表达在细胞内，呈棕黄色。MMP-2在肝细胞癌组织中的阳性率显著高于正常肝组织，差异具有显著性(P<0.05)。因此可以说 MMP-2与肝细胞癌的发生发展和侵袭转移可能都存在密切关系。

本文采用配对资料的检验计算相关系数r=0.497，P<0.05，表明VEGF与MMP-2在肝细胞癌组织中的表达呈正相关。因此推测VEGF和MMP-2在肝细胞癌发生发展、侵袭转移过程中存在协同作用。

参考文献：

[1] 王洪海,任宁,张辉,等.联合检测Vegf、Pd-Ecgf和pcna表达预测肝细胞癌术后复发及预后[J].中国临床医学, 2005,12(3):448-451.

[2] Christopoules TA,Papageorgakopoulou N，Ravasoula P，et al．Expression of metalloproteinases and their tissue inhibitom in squamous cell laryngeal carcinoma [J]．Oncol Rep，2007；18(4)：855-60．

[3] 李世朋,王胐胐,丁雪贞,等．AQP-1在肾透明细胞癌组织中的表达与临床意义[J].肿瘤基础与临床,2012,25(1):6-8.

[4] Zondor SD，Medina PJ．Bevacizumab：an angiogenesis inhibitor-with efficacy in colorectal and other malignancies[J].Ann Pharmacother,2004,38 (7-8)::1258-1264．

[5] 李映菊,汪煜牟,刘玉芙,等．白屈莱红碱对肝纤维化大鼠肝脏病理学和肝脏脯氨酸含量的影响[J].实用肝脏杂志,2009,12(3):167-170．

[6] Park YN，Kin YB．Increased expression of vascular endothelial growth factor and angiogenesis in the early stage of multistep heptocarcinogenesis[J].Arch Pattol Lab Med，2000,124(7):1061-1065．

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[8] Gao ZL,Zhang C,Du GY,et al.Clinical significance of changes in tumor markers，extracellular matrix,MMP-9 and VEGF in patients with gastric carcinoma[J].Hepatogastroenterol,2007,54(77):1591-1595．