环氧乙烷法颅骨骨粒灭菌效果观察

李 涛，范 波，杨晋生，古选民

自体颅骨片是颅骨缺损修补术最为理想的修补材料，术前材料的消毒及保存方法有高压灭菌法、辐照法、深低温(-80℃)法及环氧乙烷(ethylene oxide,EO)法。高压灭菌方法对骨组织的强度影响较大，无法满足移植后强度的要求；辐照法和深低温(-80℃)法设备要求复杂，难以在普通医院推广；EO灭菌法所需设备简单，目前多数医院配备有此类设备，并广泛应用于医疗材料和器械的消毒，但该消毒方法是否可以应用于颅骨灭菌尚存在争论。本文初步观察了游离颅骨组织用EO灭菌的效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料采用神经外科去骨瓣减压术中切除的成人颅骨片32例，其中男23例，女9例，年龄22～57岁，脑外伤27例，脑出血6例，所有骨材料均经家属同意并经我院伦理委员会批准，取顶结节处切割成1 cm×1 cm大小，内、外板及板障结构完整，全层厚约1 cm的骨粒共104粒。

1.2方法

1.2.1 消毒前预处理 3%医用双氧水常温下浸泡骨粒24 h，再次更换双氧水后浸泡24 h，去除颅骨内的残留蛋白。置于50℃烘箱内4 h，1∶1氯仿甲醇室温下脱脂4 h，更换脱脂剂后重复1次，蒸馏水反复漂洗后，在自然条件下晾干，存放于通风环境中1个月。消毒前于40℃，相对湿度40%的温箱内存放4 h预湿，用双层环氧乙烷专用剥离式包装袋包装，每袋1粒，环氧乙烷指示胶带(3M公司生产)置于内层，严格检查包装袋有无漏气及破损。

1.2.2 消毒方法 所用EO灭菌器为3M公司生产的8XL型，环氧乙烷指示胶带为3M公司提供；骨材料按一定间距装入灭菌器，灭菌方法：热循环60℃，冷循环37℃；相对湿度50%；EO浓度600 mg/L，灭菌时间5 h，且指示胶带由黄绿色变为橘红色。

1.2.3 培养方法 将上述灭菌后的骨粒分为两组，每组均为52粒，A组骨粒置于自然通风环境下10 d，B组骨粒置于自然通风环境下3个月，严格在无菌条件下粉碎成颗粒状后加入5 mL无菌生理盐水，密闭后充分震荡3 min，离心后取上清液1 mL，每组标本等分后，行需氧及厌氧细菌培养。需氧培养基为10 g/L 葡萄糖肉汤培养基，37℃恒温培养3～9 d，如有混浊，接种于羊血培养基中37℃恒温培养72 h。厌氧培养为石蕊-牛乳培养基，于35℃培养8～24 h。菌种按全国临床检验操作规程(第2版)进行鉴定，如有酵母样菌落生长，转种至沙保罗氏培养基中培养。

1.2.4 评估标准 灭菌后标本行细菌培养，以培养无细菌生长作为骨材料无菌指标，并进行阳性样本细菌的鉴定。

1.2.5 统计方法 SPSS 19.0 统计软件进行统计分析，细菌阳性率的比较采用χ2检验，α=0.05。

2 结果

A组标本培养结果：金葡菌4例，表葡菌2例，枯草芽孢菌6例，标本的阳性率为33.33%。B组标本培养结果：金葡菌5例，表葡菌2例，枯草芽孢菌8例，标本的阳性率为41.57%。两组标本均未培养出厌氧菌。两组标本阳性率相比χ2值分别为：金葡菌0.1073，表葡菌0.1324，枯草芽孢菌0.3547，总阳性率0.5333。经χ2检验均无统计学差异(P>0.05)。

3 讨论

EO是一种低分子量的环氧化合物，其分子式为C2H4O，呈无色透明状，有芳香气味。EO穿透性较强，在适当条件下，可以杀灭各类微生物，包括细菌的繁殖体、芽孢、病毒和真菌孢子。其灭菌的原理是EO与微生物的蛋白质，DNA和RNA发生不可逆的烷化作用，从而导致微生物的死亡，在目前的各种化学消毒剂或灭菌剂中效果最好。

EO的灭菌效果受以下4种因素影响：灭菌温度、相对湿度、EO浓度和灭菌时间，上述各值除EO浓度外，其余各值越大，灭菌效果越好，EO的最佳浓度取决于其他参数值。一般用于同种异体骨灭菌的参数为：温度20～60℃；有效湿度30%～60%；EO浓度450～1 500 mg/L，灭菌时间2～5 h[1]。本实验采用的参数接近于灭菌最有效值。

EO易于穿透剥离式包装袋，残留量较少，有人建议灭菌后的保存有效期为10个月[2]。颅骨的板障部分处于两层致密的骨皮质之间，其内为蜂房状结构，阻碍了EO的进一步挥发和穿透。在类似实验中皮质骨的标本阳性率较低[2]，本实验阳性率与之相比有所增加并随着保存时间的延长阳性率增高，可能与松质骨的结构对EO的穿透性阻碍有关。这也导致松质骨的保存时间可能更短。

制备符合修补的自体颅骨片有两个关键因素：颅骨片的强度和颅骨灭菌的彻底性，有报道认为，EO仅能穿透致密的皮质骨约6 mm，建议仅用于颗粒骨的灭菌[2]。颅骨修补所用的材料可以在颅骨上打孔以增加颅骨内、外侧组织的爬行，加速移植的骨支架与组织的融合，同时也增加了灭菌的有效性，这是本文对这种灭菌方法应用探讨的基础。就目前现有的技术条件，很难做到使骨孔间的骨体积均小于6 mm×6 mm，EO对整块游离颅骨片的灭菌效果必定更不理想，这与Jho等采用此方法临床实践结论不一致[3-4]。

本实验的培养结果也证实了不同的微生物对EO的耐受性不相同：杆菌对EO灭菌敏感，而球菌则相对较差，芽孢对EO的抵抗最强；厌氧菌及真菌对EO的耐受性也较差。

用于回植的离体骨灭菌方法有多种，其中除EO法外，较为可行的有γ射线辐照、深低温保存(-80℃)、巴氏灭菌法及高压蒸汽灭菌等方法，其中以高压蒸汽灭菌法对骨强度的破坏最明显，其次为γ射线辐照，EO灭菌法对骨强度的破坏最小[5]，标准25 kGy的剂量辐照后，骨的抗压缩性能降低25%，而且回植后移植骨的吸收也显著增加[6-7]，由于辐照设备的复杂性，不适合医院使用。本实验结果表明，单纯EO灭菌法不适合游离颅骨片自体移植使用，能否找到一种既达到理想的灭菌效果，又保持颅骨片的强度的方法需要进一步探索，将上述灭菌方法结合起来使用可能是可行的方法。

参考文献：

[1] 黄靖雄.环氧乙烷灭菌[J].中华医院感染学杂志，2004,14(12):1435-1439.

[2] Wingenfeld C，Egli RJ,Hempfing A，et al.Cryopreservation of osteochondral allografts:dimethyl sulfoxide promotes angiogenesis and immune tolerance in mice[J].J Bone Joint Surg Am,2002,84(8):1420-1429.

[3] Jho DH,Neckrysh S,Hardman J,et al.Ethylene oxide gas sterilization:a simple technique for storing explanted skull bone[J].J Neurosurg,2007,107(2):440-445.

[4] Misssori P,Polli FM,Rastelli E,et al. Ethylene oxide sterilization of autologous bone flaps following decompressive craniectomy[J].Acta Neurochi,2003,145(10):899-903.

[5] Zhou Z,Qin T,Yang J,et al.Mechanical strength of cortical allografts with gamma radiation versus ethylene oxide sterilization[J].Acta Orthop Belg,2011,77(5):670-675.

[6] Nguyen H,Morgan DA,Forwood MR.Sterilization of allograft bone: effects of gamma irradiation on allograft biology and biomechanics [J].Cell Tissue Bank,2007,8(2):93-105.

[7] Biau DJ,Larousserie F,Thévenin F,et al.Results of 32 allograft-prosthesis composite reconstructions of the proximal femur[J].Clin Orthop Relat Res,2010,468(3):834-845.