响应面优化酶法澄清琯溪蜜柚汁工艺研究

许 键，蔡慧农,2,3，倪 辉,2,3，杜希萍,2,3，黄高凌,2,3

(1.集美大学生物工程学院，福建 厦门 361021； 2.福建省高校食品微生物与酶工程技术研究中心，福建 厦门 361021；3.厦门市食品与生物工程技术研究中心，福建 厦门 361021)

响应面优化酶法澄清琯溪蜜柚汁工艺研究

许 键1，蔡慧农1,2,3，倪 辉1,2,3，杜希萍1,2,3，黄高凌1,2,3

(1.集美大学生物工程学院，福建 厦门 361021； 2.福建省高校食品微生物与酶工程技术研究中心，福建 厦门 361021；3.厦门市食品与生物工程技术研究中心，福建 厦门 361021)

以琯溪蜜柚为主要原料，利用响应面法对酶法澄清琯溪蜜柚汁工艺进行优化.在单因素基础上选取试验因素与水平，根据 Box-Benhnken 试验设计原理，采用三因素三水平的响应面分析法，对各个因素的显著性和交互作用进行分析，以透光率为响应值作响应面曲线图和等高线图，并建立了工艺数学模型.结果表明：酶法澄清蜜柚汁工艺的最佳参数为果胶酶浓度200 U/mL、酶解温度49 ℃、酶解时间40 min；并对结果进行验证，在此条件下，蜜柚汁透光率为97.2%，与预测值97.5%接近.说明，根据Box-Behnken模型并采用响应面分析法得到的酶法澄清蜜柚汁优化工艺准确、可靠.

琯溪蜜柚汁；酶法澄清；优化；响应面

0 引言

澄清汁在保持果汁原有风味的基础上，可使果汁产品的稳定性、色泽和外观大大改善.因此，澄清果汁在果汁及饮料产品中占有越来越重要的地位[1].琯溪蜜柚由于果实品质好、皮薄多汁、清甜醇蜜、酸甜适中、成熟期早等诸多优势而深受果农和消费者的欢迎，市场占有率逐年增加，目前已成为福建占领国内外市场的主要果品之一[2].琯溪蜜柚不仅是美味果品，更是天然的保健食品.据文献[3-6]报道，每100 mL果汁含可溶性固形物10.7～11.6 g、糖9.17～11.6 g、酸0.73～1.0 g、维生素C 48.93～51.98 mg，同时含有镁、钙、铜、铁、铝、钛、锰、钒、磷、氯等10多种对人体有益的矿物质元素.蜜柚果汁还含有大量的果胶，以及大量的纤维素、半纤维素等物质，这些物质能促进肠道蠕动，增强肠胃功能，降低血液中胆固醇的含量，起到保护心血管的功能.但这些物质也使得柚子汁加工过程中和保质期内易发生沉淀、絮凝等现象，影响产品的外观和口感，从而严重影响了柚汁的商业价值.随着蜜柚果汁脱苦加工技术的完善，柚子果汁生产中的澄清将是一个亟待解决的重要技术，也是蜜柚果汁加工的关键环节. 由压榨方法制得的原果汁中出现的果实细胞碎片、一些不溶性成分和一些固体大分子物质(如多酚类物质、蛋白质、果胶、纤维素等)，这些物质将引起果汁浑浊，导致果汁在储藏期间出现品质恶化，使果汁的贮藏期明显缩短.文献研究表明[7-8]，生产澄清果汁可以解决此问题.目前在果汁生产中常用的澄清方法主要有自然澄清法、离心分离法、热处理法、冷冻法、酶法、澄清剂法和超滤法等[9-11].果胶酶是酶法澄清工艺中最常用的酶制剂，它能水解呈负电性的果胶物质，使果汁中其他大分子和带正电颗粒失去果胶的保护作用，通过静电平衡，和还没有完全分解的带负电的果胶分子凝聚，中和而沉淀，使之达到澄清净化的效果[12].澄清型柚子汁及其饮料是国际市场需求的新动向，国内尚未见其开发应用的报道.本文研究了果胶酶用量、酶解温度、酶解时间对琯溪蜜柚汁澄清效果的影响，通过响应面试验优化确定酶解的最佳工艺条件.

1 材料与方法

1.1 材料

琯溪蜜柚，购自漳州市平和县；商品果胶酶制剂(5×105U/g)，购自和氏璧生物技术有限公司.

1.2 仪器设备

HH-4 型恒温水浴锅，常山国华电器有限公司；Unic7200型紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司；101-3B型电热恒温鼓风干燥箱，上海市实验仪器总厂；BS223S型电子天平，赛多利斯科学仪器；LXJ-IIB型低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂.

1.3 方法

1.3.1 蜜柚澄清汁的制备 原料选择→清洗→去皮→囊瓣分离、去囊衣→取囊瓣→打浆→压榨挤汁→原汁→澄清→离心过滤→清汁备用.

1.3.2 离心澄清工艺 取蜜柚汁原汁5 mL，在25 ℃下于3000、3500、4000 r/min 离心，时间分别为5、10、15、20、25、30、35 min，取上层清液测定透光率，探讨离心对蜜柚原汁澄清度的影响.

1.3.3 自然静置澄清工艺 取蜜柚汁原汁5 mL，在25 ℃下分别静置1，2，3，4，5 h，取上层清液测定透光率，探讨静置时间对蜜柚原汁澄清度影响.

1.3.4 蜜柚汁果胶酶澄清工艺 取蜜柚汁原汁5 mL，分别取果胶酶 100、200、300、400、500、600、700 U/mL ，在 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃下 ，酶解15、30、45、60、75、90、105、120 min，煮沸10 min灭酶后冷却备用.在单因素基础上，以酶用量、酶解温度和酶解时间为因素，采用响应面进行优化试验，确定最佳酶解条件.

1.3.5 透光率测定 采用分光光度法.果汁经3000 r/min离心5 min，取上清液以蒸馏水作参比，比色杯厚 1 cm，在 660 nm 处测定果汁的透光率T.

1.4 数据分析

根据试验所得蜜柚果汁透光率变化数据，采用Microsoft Excel 2010进行统计分析并绘图；采用设计专家 Design-Expert 8.0.5 b软件中的Response Surface程序进行响应面实验设计，应用ANOVA程序进行方差分析，应用 Model Graph 程序作响应曲面图和等高线图，应用Optimization 程序中 Numerical 分析得预测最优值.根据试验取得的数据建立回归方程：Y=∑A0+∑AiXi+∑AiiXii+∑AijXiXj，式中：Y(透光率)为响应值；A0为常数项；Ai、Aii、Aij分别为一次项、平方项和交互项的回归方程系数；Xi和Xj为自变量.

2 结果与分析

2.1 离心法澄清蜜柚汁试验

由图1可以看出，在室温下离心处理前25 min内，蜜柚的透光率随着离心时间的增加而升高的趋势较为明显，可能由于悬浮物在离心力的作用下迅速沉降，随着离心时间的延长，悬浮物沉降得越多，透光率越高.但离心时间超过25 min 时，3000 r/min、3500 r/min 和 4000 r/min 条件下透光率上升趋势都不明显；另外，相同的离心时间时，蜜柚在 4000 r/min 的转速下，透光率较高.所以，离心澄清效果最佳条件为转速4000 r/min离心25 min，透光率为87.0%.

2.2 自然澄清法澄清蜜柚汁试验

在果汁置于密闭容器中，经长时间静置，使悬浮物沉淀.在静置过程中，蛋白质和多酚类物质也可逐渐形成不溶性的沉淀，所以长时间静置可以使果汁得到澄清.由图2可知，当蜜柚汁不进行澄清时，透光率为30.8%.自然澄清时间在5 h之内时，随着静置时间的延长，透光率变化不大，在1 h时，透光率为48.4%，但之后透光率增加不显著.但综合考虑，此法仍达不到所需要的果汁澄清度.

2.3 酶法澄清蜜柚汁试验

2.3.1 果胶酶浓度对澄清效果的影响

果胶酶浓度对蜜柚汁澄清效果的影响如图3所示.由图3可以看出，在45 ℃下果胶酶澄清处理蜜柚汁30 min，果汁的透光率得到较大的提高，果胶酶浓度对蜜柚汁澄清效果有显著影响.果胶酶浓度从0增加到200 U/mL时，果汁透光率出现峰值.当果胶酶浓度超过200 U/mL时，随着酶浓度的增加，果汁中的大部分果胶物质已经降解，果汁透光率逐渐趋于稳定.因此，响应面分析中果胶酶浓度因素水平分别选取100～300 U/mL.

2.3.2 酶解温度对澄清效果的影响

图4显示的是在不同温度下，200 U/mL果胶酶澄清处理蜜柚汁30 min的透光率.由图4可见，当温度为 50 ℃时，蜜柚汁的澄清达到最高，当温度继续升高，蜜柚汁的澄清度反而降低.这可能是由于温度过高，果胶酶被钝化而活性受抑制；同时过高温度使少量的大分子沉淀物质重新溶解到蜜柚汁中，因此透光率呈现下降趋势.因此，响应面分析中果胶酶作用温度的因素水平选用45～55 ℃.

2.3.3 酶解时间对澄清效果的影响

由图5可知，在50 ℃下200 U/mL果胶酶澄清处理蜜柚汁的前45 min，果汁的透光率随时间的延长呈不断上升趋势；45 min后，果汁透光率的提高相对变缓.可能是因为随着沉淀时间的延长，沉淀越来越紧实，体积变小，沉淀量不再增加，视为沉淀过程已经结束.但若作用时间过短，果胶酶对果胶的分解不完全，影响澄清效果.因此，响应面分析中果胶酶作用时间的因素水平选用30～60 min.

2.3.4 响应面法组合设计及试验结果

表1 Box⁃Behnken试验因素和编码水平表Tab1 FactorsandlevelsofBox⁃Behnkenexperimentaldesign因素Factor编码水平Codinglevel-10+1A酶浓度Enzymeconcentration/(U·mL-1)100200300B温度Incubationtemperature/℃455055C时间Incubationtime/min304560

1)根据单因素试验结果，取酶浓度、温度、时间 3 个因素作为响应面中心组合设计的影响因子，确定出各因子的适宜水平，其试验因素和编码水平如表 1 所示.

2)酶解澄清试验分析和回归方程的建立.以蜜柚汁透光率为指标进行响应面优化实验，采用 Design Expert 软件[13-14]中Response Surface程序设计的试验及优化的17 组试验结果见表2.利用Design Expert 软件中ANOVA程序对表 2 试验数据进行方差分析及回归系数显著性检验，结果见表3和表4.回归方程的方差分析显示，模型的“Prob>F”为0.0011，说明该模型高度显著.决定系数R2=0.9473，说明仅有约不到6%的果汁透光率数据不能用该模型解释，失拟项P值为0.0779，失拟不显著，说明方程拟合充分，预测值与实验值之间有较高的相关度，可以用该回归方程代替真实实验点结果进行分析.

由表4可知，一元二次回归方程为：Y=0.064A-0.05B-0.44C-0.100AB-0.13AC+0.3BC-0.69A2-0.52B2-0.69C2+ 97.46，方程中变量为编码值.一次项除了C(时间)(P=0.0016)以外，A(酶浓度)(P=0.5009)、B(温度)(P=0.588)都对结果无显著影响；二次项中A2(P=0.0007)、B2(P=0.0037)、C2(P=0.0037)对结果有极显著影响；交互项中BC(P=0.0469)交互作用显著，其余交互项均不显著，表明实验因子对实验响应值不是简单的线性关系，而是呈二次关系，且三因素之间存在交互作用.方程中各项系数绝对值大小直接反映各因数对响应值的影响程度，系数的正、负反映影响的方向.依据系数估计值A=0.062、B= -0.050、C= -0.44，可知影响因子的主效应顺序为：C>A>B.

表2 Box-Behnken试验设计方案及结果

表3 回归模型方差分析

变异来源Sourceofvariation平方和Sumofsquares自由度Degreesoffreedom均方MeansquareF值FvalueP值Pvalue模型Model7．80090．87013．970．0011残差Residuals0．43070．062失拟Lackoffit0．34030．1104．960．0779误差Error0．09240．023总和Sum8．24016R2=0．9473

表4 回归模型系数的显著性检验

3)响应面交互作用和回归模型的优化.通过Design-Expert 8.0.5 b 软件中 Model Graph 程序作出响应曲面图和等高线图，通过图形可以直观地展示响应值与实验参数水平之间的关系.等高线的形状可以反映交互效应的强弱，圆形表示两个因素之间交互作用不显著，椭圆形表示两个因素交互作用显著[15].通过观察可以发现，果胶酶浓度与酶解温度、酶解时间没有显著的交互作用，而酶解温度与酶解时间有显著的交互作用.图6是以果胶酶浓度和酶解温度为变量生产的响应面图，从图6中可以看出，当果胶酶处理时间为45 min时，随着果胶酶浓度与果胶酶处理温度的不断增大，蜜柚果汁透光率呈现出先上升后下降的趋势，当果胶酶浓度在200 U/mL、果胶酶处理温度在50 ℃附近时，蜜柚果汁透光率有最大值.图7是以果胶酶浓度和酶时间为变量生产的响应面图，从图7中可以看出，当果胶酶处理温度为50 ℃时，随着果胶酶浓度与果胶酶处理时间的不断增大，蜜柚果汁透光率呈现出先上升后下降的趋势，当果胶酶浓度在200 U/mL、果胶酶处理时间在45 min附近时，蜜柚果汁透光率有最大值.图8所示2D图形轮廓呈现椭圆形，结合分析结果中BC有较小的P值(0.046)，可见果胶酶处理温度与果胶酶处理时间交互作用显著，且当果胶酶浓度在200 U/mL时，在果胶酶处理时间在45 min、果胶酶处理温度50 ℃附近，蜜柚果汁透光率有最大值.

4)最佳工艺条件确定与验证.根据Design-Expert 8.0.5 b软件的 Optimization 程序中 Numerical 分析，可得到该模型的最大估计值为98.5%，参数的最佳水平是：A(酶浓度)为200 U/mL，B(温度)为49 ℃，C(时间)为40 min.在上述参数最优值的情况下，进行验证，试验结果分别为97.2%、97.1%、97.5%、97.3%、97.3%、97.1%，平均实测值(97.2±0.15%)与预测值97.5%相近，相对误差在2%以下，证明应用响应面法优化果胶酶澄清蜜柚汁的关键因子是可行的，优化模型有较好可靠性.

2.4 几种澄清方法的比较

由图9可知:比较离心澄清、自然澄清和果胶酶澄清法对蜜柚汁澄清效果，以果胶酶澄清效果最好，所需时间也最短，澄清40 min 透光率就已达到 97.2%，分别比离心澄清法和自然澄清法高10.3%、48.9%.比较离心澄清和自然澄清，二者澄清效果有显著性差异，在转速4000 r/min下离心25 min后透光率达到87.0%，明显高于自然澄清的.

3 结论

1)果胶酶法澄清蜜柚汁效果明显优于离心澄清法和自然澄清法.在单因素实验基础上确定了果胶酶法响应面试验设计的因素水平为酶浓度100～300 U/mL、酶解温度45～55 ℃、酶解时间30～60 min.

2)通过试验结果的方差分析及回归系数显著性检验可知，果胶酶法澄清蜜柚汁条件优化数学回归模型为：Y=0.064A-0.05B-0.44C-0.100AB-0.13AC+0.3BC-0.69A2-0.52B2-0.69C2+97.46.采用此模型在本试验范围内能较准确地预测蜜柚汁的透光率.在本实验范围内，各因素对果胶酶法澄清蜜柚汁的影响作用大小顺序依次为：酶解时间>酶浓度>酶解温度.

3)果胶酶法澄清蜜柚汁的最佳工艺参数为酶用量 200 U/mL、酶解温度49 ℃和酶解时间44 min，在此条件下，理论透光率达到97.5%，而实际测得的蜜柚汁的透光率为97.2%，与理论预测值的相对误差小于2%.实验值与理论值是吻合的，证明了该模型是合理可靠的.

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(责任编辑 马建华 英文审校 曹敏杰)

Optimization of Enzymatic Clarification of Guanxi Pomelo Juice Using Response Surface Methodology

XU Jian1，CAI Hui-nong1,2,3，NI Hui1,2,3，DU Xi-ping1,2,3，HUANG Gao-ling1,2,3

(1.College of Biological Engineering，Jimei University，Xiamen 361021，China;2.Research Center of Food Microbiology and Enzyme Engineering Technology，Jimei University，Fujian Province University，Xiamen 361021，China;3.Research Center of Food Biotechnology of Xiamen City，Xiamen 361021，China)

To optimize the process for clarifying Guanxi pomelo juice，a series of single-factor experiments were made to investigate the effects of enzyme concentration，incubation time，incubation temperature on the clarity of the product.Based on single-factor experiments，a 17-run response surface design involving 3 factors at 3 levels was generated by the Design-Expert software according to the Box-Behnken design principle and experimental data thus obtained were subjected to quadratic regression analysis to create a mathematical model for clarification.The optimal enzyme clarification condition was using 200 U/mL of enzyme,and react at 49 ℃ for 40 min.Under these conditions，the clarity of pomelo juice reached 97.2%.This was similar to the estimated value of 97.5%.

Guanxi pomelo juice；enzymatic clarification;optimization；response surface methodology

2013-09-26

2013-11-05 [基金项目]国家自然科学基金资助项目(31371751)；福建省自然科学基金资助项目(2011J01225)；福建省教育厅项目(JA12188)；厦门市杰出青年人才基金项目(3502Z20126008)；集美大学科研创新团队基金资助项目(2010A006)

许键(1988—)，男，硕士生，主要从事食品化学方向研究.通讯作者：黄高凌(1966—)，女，副教授，从事食品化学方向研究，E-mail:hgaol@jmu.edu.cn.

1007-7405(2014)02-0100-07

TS 255.44

A