促进剂对枯草芽胞杆菌CICC20958产肌苷的影响

游洪燕,杨 哲,肖安风,2,3,4 ,倪 辉,2,3,4,蔡慧农,2,3,4,杨秋明,2,3,4

(1.集美大学生物工程学院,福建 厦门361021;2.福建省食品微生物与酶工程重点实验室,福建 厦门 361021;3.福建省高校食品微生物与酶工程技术研究中心,福建 厦门361021;4.厦门市食品生物工程技术研究中心,福建 厦门361021)

促进剂对枯草芽胞杆菌CICC20958产肌苷的影响

游洪燕1，2,杨 哲1,肖安风1,2,3,4,倪 辉1,2,3,4,蔡慧农1,2,3,4,杨秋明1,2,3,4

(1.集美大学生物工程学院,福建 厦门361021;2.福建省食品微生物与酶工程重点实验室,福建 厦门 361021;3.福建省高校食品微生物与酶工程技术研究中心,福建 厦门361021;4.厦门市食品生物工程技术研究中心,福建 厦门361021)

根据肌苷的代谢调控机理，选择柠檬酸钠、NaF、CaCl2、次黄嘌呤、MnSO45种肌苷促进剂，考察它们的不同添加量对枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis,简称Bs)CICC20958菌株产肌苷的影响，采用均匀设计法得到最佳组合添加方案.结果表明，在促进剂柠檬酸钠、NaF、CaCl2、次黄嘌呤、MnSO4质量浓度分别为7.9、0.001、0.032、2.1、0.2 g/L的条件下发酵，菌株Bs CICC20958的肌苷产量达到7.81 g/L，比不添加促进剂实验组(对照组)的肌苷产量提高了5.38倍.

枯草芽胞杆菌；CICC20958；肌苷；促进剂；均匀设计试验

0 引言

肌苷(Inosine)又名次黄嘌呤核苷，它是食品增鲜剂5′-肌苷酸钠、呈味核苷酸二钠的主要原料之一[1]，它在临床上被广泛用于心脏病、肝病、白血球减少症、血小板减少症等疾病的治疗[2-4].枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis,简称Bs)主要通过糖酵解途径(EMP途径)和戊糖磷酸途径(HMP途径)进行分解代谢，提高葡萄糖代谢途径中关键酶的活力以促进肌苷的合成.郭元昕等[5]在培养基中添加质量分数2%的葡萄糖酸钙，使肌苷产量达到18.36 g/L，比不添加时提高70%.刘新星等[6]在发酵的基础料中添加了质量分数0.2%的柠檬酸钠，发现柠檬酸钠的添加降低了EMP途径中的6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活力，使肌苷产量提高18%，肌苷对葡萄糖得率增加38%.Wu等[7]证明了在摇瓶培养基中加入0.2 ～0.5 g/L的柠檬酸可以显著提高D-核糖产量，并在7 L发酵罐上进行了放大验证.此外，在肌苷生产菌的发酵培养基中添加适量的前体物次黄嘌呤，使嘌呤碱基通过补救途径直接合成核苷，从而也可以增加肌苷的生成量[8-10].Mn2+[11]、酵母粉[12]、MnSO4[13]、Na2MoO4[13]、CoCl2[13]等添加物同样可促进肌苷的产量.本文选取了柠檬酸钠、CaCl2、NaF、次黄嘌呤、MnSO45种促进剂添加到产肌苷的摇瓶发酵培养基中，在单因素的基础上，再采用均匀设计方法优化促进剂组合添加的方案，探究这5种促进剂对Bs CICC20958产肌苷代谢过程中某些关键酶的影响，以及其如何促进肌苷产量.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4、CaCO3、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉等分析纯试剂均购于国药集团化学试剂北京有限公司；酵母膏购于上海华美生物公司；玉米浆(含47.5%干物质)由厦门汇盛生物有限公司提供；肌苷标准样品购于美国Sigma公司；甲醇(色谱纯) 购于美国天地公司.

1.2 培养基成分

1)斜面培养基(g/L) ：葡萄糖5，蛋白胨10，酵母膏5，氯化钠2.5，琼脂20，pH=7.2，0.1 MPa灭菌15 min.

2)种子培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏15，玉米浆12，氯化钠2.5，尿素2，pH=7.2，0.1 MPa灭菌15 min.

3)初始发酵培养基(g/L)：葡萄糖150，酵母膏10，玉米浆12，尿素6，MgSO41，KH2PO32.5，氯化钾1，pH=7.0，0.1 MPa灭菌15 min.

1.3 实验方法

1) 菌种培养方法 将保藏菌种接种于斜面培养基，在37 ℃下活化18 h.从斜面取一环菌种，接种于含25 mL种子培养基的摇瓶中，在34 ℃、220 r/min下培养18 h.将培养好的种子液按5%的接种量加入到含25 mL发酵培养基的摇瓶中，34 ℃、280 r/min发酵72 h.

2) 生物量检测 从摇瓶中均匀吸取0.1 mL发酵液，用蒸馏水梯度稀释至80倍，在660 nm的波长下测吸光度值.

3)肌苷产量测定 参考文献[14].从摇瓶中均匀吸取发酵液，离心后吸取上清液，用去离子水梯度稀释50倍.稀释后的样品用0.22 μm膜过滤后，高效液相色谱法测肌苷浓度.

色谱条件为：Symmetry型C18反相柱(柱径4.6 mm×150 mm)，流动相为水(质量分数0.5%磷酸)和甲醇，流速0.6 mL/min，波长248 nm，梯度洗脱.

4)菌株Bs CICC20958均匀试验设计 在均匀设计试验中，分别设柠檬酸钠、NaF、CaCl2、次黄嘌呤、MnSO45个因素为自变量X1、X2、X3、X4、X5，肌苷产量为自变量Y，选择五因素八水平的均匀设计模型(U8*(85))设计试验.

5)试验因素水平 将柠檬酸钠、NaF、CaCl2、次黄嘌呤、MnSO45个因素，结合前期已经完成的单独添加促进剂的结果，设计8个水平进行均匀设计优化.因素及水平设置见表1，按照均匀设计模型设计的具体试验方案见表2.按表2所设计具体试验方案进行肌苷摇瓶发酵，测得肌苷产量填入表2的响应值栏.

表1 U8∗(85)因素及水平表Tab1 FactorslevelsbasedonU8∗(85)g/L水平Levels因素FactorsX1X2X3X4X5110．0010．0041．00．025220．0020．0081．50．050330．0030．0122．00．075440．0040．0162．50．100550．0050．0203．00．125660．0060．0243．50．150770．0070．0284．00．175880．0080．0324．50．200表2 BsCICC20958均匀试验设计和结果Tab2 ResultsofuniformdesignofBsCICC20958basedonU8∗(85)g/L试验号No因素FactorsX1X2X3X4X5响应值YResponsevalue110．0020．0164．00．2006．31220．0040．0323．00．1755．91330．0060．0122．00．1504．26440．0080．0281．00．1252．23550．0010．0084．50．1007．24660．0030．0243．50．0755．74770．0050．0042．50．0054．55880．0070．0201．50．0253．09

2 结果与讨论

2.1 单一促进剂对菌株Bs CICC20958发酵和肌苷产量的影响

2.1.1 柠檬酸钠对Bs CICC20958菌株发酵的影响 柠檬酸钠是一种研究较多的促进剂，在提高肌苷产量方面可以达到很好的效果[15-17].在肌苷发酵的培养基中分别加入1、2、3和4 g/L的柠檬酸钠，研究它们在肌苷发酵中对Bs CICC20958生物量及肌苷产量的影响，其结果如图1所示.由图1可以看出，添加0～3 g/L的柠檬酸钠，生物量及肌苷产量随着柠檬酸钠添加量的增加而增加.当柠檬酸钠质量浓度为3～4 g/L时，肌苷及生物量均呈现下降趋势.在3 g/L柠檬酸钠条件下，生物量为32.08，肌苷的产量最高达到1.92 g/L，其中肌苷产量较不添加柠檬酸钠的空白组提高了53%.据报道，柠檬酸盐可以增强枯草芽胞杆菌对Ca2+的吸收，而Ca2+是丙酮酸激酶的一种强烈抑制剂，当丙酮酸激酶活力下降时，会造成EMP途径中的磷酸烯醇式丙酮酸大量积累，而磷酸烯醇式丙酮酸又是磷酸果糖激酶的强烈抑制剂.其次，磷酸果糖激酶是一种变构酶，柠檬酸盐和ATP都对其有变构抑制的效果，胞内的柠檬酸盐可以通过加强ATP的抑制效应来抑制磷酸果糖激酶.由此推断，柠檬酸钠可以同时降低枯草芽孢杆菌中心代谢途径中的丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶的活力，使EMP途径的流量减弱[5].另外，柠檬酸合成酶是TCA循环的限速酶，添加柠檬酸钠会竞争性抑制柠檬酸合成酶的活性[6]，所以添加适量柠檬酸钠可以限制TCA代谢流量，减少碳架浪费.

2.1.2 CaCl2对菌株Bs CICC20958发酵和肌苷产量的影响 本试验在肌苷发酵培养基中分别加入了0、0.005、0.01、0.015和0.02 g/L的CaCl2，考察其对肌苷产量及生物量的影响，实验结果如图2所示.由图2可知，添加一定量的CaCl2可以有效促进肌苷的合成.当添加CaCl2质量浓度为0.01 g/L时，肌苷产量比不添加CaCl2的空白组提高32%.当CaCl2质量浓度大于0.01 g/L 时，生物量及肌苷产量和CaCl2添加量成反比关系.作为丙酮酸激酶的抑制剂，添加适量的Ca2+可以有效降低丙酮酸激酶的活力[5]，使EMP途径中的磷酸烯醇式丙酮酸不断积累，进而对磷酸果糖激酶产生相应的抑制作用.从结果中还可以发现，在CaCl2质量浓度为0.005～0.010 g/L时，随着加入培养基中的CaCl2浓度的增大，生物量略有提高，但肌苷产量随着CaCl2浓度的增加而迅速增加.Ca2+可以中和肌苷发酵过程中产生的有机酸等副产物，使发酵液的pH值维持在比较理想的水平，为菌体提供良好的生长环境.

2.1.3 NaF对菌株Bs CICC20958发酵和肌苷产量的影响 在肌苷发酵的培养基中加入0.001、0.002、0.003和0.004 g/L的NaF，考察其对肌苷发酵的影响，结果见图3.由图3可知，添加NaF对肌苷产量和菌体生长都具有一定的促进作用，但是高浓度的NaF则不利于肌苷的积累.从图3中还可以看出，NaF质量浓度为0.003 g/L时，肌苷产量达到最高1.68 g/L，比不添加NaF的空白组提高35%.分析原因，可能是因为NaF具有抑制细菌产酸的作用，可以明显减弱培养基pH值的下降，一般可以使pH值保持在6.2以上[18].因此随着NaF添加量的增加，枯草芽孢杆菌的生物量呈现出不断上升的趋势.此外，氟化物是EMP途径中烯醇化酶的强烈抑制剂，使该途径的代谢流得到抑制，减弱了EMP途径的通量，从而使得合成肌苷的代谢流增强，肌苷产量增加.

2.1.4 次黄嘌呤对菌株Bs CICC20958发酵和肌苷产量的影响 肌苷在枯草芽胞杆菌中的合成可以通过两种不同的途径来完成，即全合成途径和嘌呤核苷酸的补救途径[19].次黄嘌呤的添加可以为肌苷合成提供现成的嘌呤环，从而通过补救合成促进肌苷产量的提高.因此，本实验考察了在培养基中分别添加0、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L的次黄嘌呤对肌苷产量的影响，结果见图4.从图4中可以看出，在考察范围内，肌苷的产量与次黄嘌呤的添加量成正比关系.根据报道[20-21]，这可能是因为在肌苷的发酵生产中，补救途径具有重要的功能，因为在其发酵的后期，各种营养成分的消耗会引起碳与氮之间比例的失调，以及pH值的改变，从而导致全合成途径受到阻碍.此时，在培养基中添加嘌呤类物质可以启动补救途径，促进肌苷的持续合成.据对次黄嘌呤和肌苷分子质量的比较，1单位的次黄嘌呤理论上可以合成2单位的肌苷，这与本试验中添加次黄嘌呤浓度2.5 g/L，肌苷产量增加4.58 g/L的结果相当，此时的肌苷产量是不添加次黄嘌呤空白组的4.66倍.

2.1.5 MnSO4对菌株Bs CICC20958发酵和肌苷产量的影响 在肌苷发酵培养基中尝试加入0、0.025、0.05、0.075、0.1 g/L的MnSO4，考察其对肌苷发酵的影响，结果见图5.从图5中可以看出，添加适量的MnSO4确实可以提高肌苷的产量.当添加MnSO4质量浓度为0.05 g/L时，肌苷产量为1.65 g/L，比不添加MnSO4的空白组提高32%.因为Mn2+是微生物生长的必需元素，当培养基中缺少Mn2+时，不适合Bs的生长，但是会促进芽孢的形成，对肌苷产量有抑制作用[22]，加入MnSO4后可以为菌体繁殖提供更多的空间.又因为Mn2+在适当浓度时可以诱导6-磷酸葡萄糖脱氢酶，在HMP途径中，肌苷合成的重要前体5-磷酸核糖即是6-磷酸葡萄糖在6-磷酸葡萄糖脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶相继催化完成的[13]，所以添加适当浓度的MnSO4可以有效促进肌苷产量的增加.

2.2 菌株Bs CICC20958组合添加促进剂的均匀设计法优化

表3 BsCICC20958均匀试验回归方程显著性分析Tab3 ResultsofregressionofBsCICC20958basedonuniformdesign因素Factors偏相关Partialcorrelationt-检验t-testP值PvalueX1∗X1-0．33800．37630．0412X2∗X2-0．98110．27000．0001X3∗X3-0．21900．30760．6023X1∗X2-0．80930．56530．0150X2∗X5-0．48600．30720．0222X3∗X50．08280．34060．8455

对于已获得的试验结果，通过DPS7.05软件对结果进行分析，并采用二次多项式逐步分析得到肌苷产量(Y)对各个因素的回归方程的显著性分析(见表3)，所得到的回归方程为：Y=6.1050+4.9668×10-2X1*X1-1.9170×104X2*X2-1.1467×103X3*X3-9.0327×10X1*X2-7.9151×102X2*X5+3.8487×102X3*X5，R2=0.9913，P=0.002439.可见，模型的P值小于0.05，说明该模型高度显著；方程的相关系数R2=0.9913，说明仅有不到1%的肌苷产量变异不能用该模型解释，预测值与实验值之间有较高的相关度，可以用该回归方程代替真实试验点进行分析.由表3可知，各因素之间存在一定的交互作用，对于肌苷产量的影响大小排序为X2*X2>X1*X2>X2*X5>X1*X1>X3*X3>X3*X5.

通过软件对回归方程进行求导，可以得到各个因素的极值点，当这些极值点组合后，理论上肌苷产量达到最大值，各种促进剂的最佳参数见表4.

表4 各因子最优参数

在最优配方条件下进行均匀设计结果的验证试验，与不添加促进剂时的肌苷产量进行对比，结果显示，通过均匀设计的试验方法对添加促进剂组合的方案进行优化，并采用优化后的各促进剂的最佳参数进行验证试验，结果使肌苷产量达到7.81 g/L.相对于优化前不添加促进剂的肌苷产量1.22 g/L，优化后的肌苷产量提升了5.38倍，说明将均匀设计的试验方法应用于肌苷发酵过程中促进剂组合添加方法的优化是可行的.

3 结论

本文分别考察了5种促进剂在不同浓度下对Bs CICC20958发酵产肌苷的影响，得到5种促进剂单独添加时的最佳质量浓度(g/L)分别为：柠檬酸钠3，CaCl20.01，NaF 0.003，次黄嘌呤2.5，MnSO40.05.在此基础上，采用均匀设计方法优化促进剂组合添加的方案，结果显示，当同时添加柠檬酸钠7.9 g/L、NaF 0.001 g/L、CaCl20.032 g/L、次黄嘌呤2.1 g/L、MnSO40.2 g/L时，可以使肌苷产量达到最大值.经验证，在此条件下该菌株的产肌苷能力与不添加促进剂相比提高了538%，达到7.81 g/L.

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(责任编辑 马建华 英文审校 曹敏杰)

Effect of Accelerators on Inosine Production ofBacillussubtilisCICC20958

YOU Hong-yan1,2,YANG Zhe1,XIAO An-feng1,2,3,4,NI Hui1,2,3,4,CAI Hui-nong1,2,3,4,YANG Qiu-ming1,2,3,4

(1.College of Biological Engineering,Jimei University,Xiamen 361021,China;2.Fujian Provincial Key Laboratory of Food Microbiology and Enzyme Engineering,Xiamen 361021,China;3.Research Center of Food Microbiology and Enzyme Engineering Technology of Fujian Province,Xiamen 361021,China;4.Research Center of Food Biotechnology of Xiamen City,Xiamen 361021,China)

According to the regulating mechanism of inosine synthesis,some kinds of effective additives(sodium citrate,NaF,CaCl2,hypoxanthine and MnSO4) were added inBacillussubtilisCICC20958.Then,the best composition of accelerators was obtained by uniform design.The results showed that optimized combination increased inosine production to 7.81 g/L in the presence of 7.9 g/L sodium citrate,0.001 g/L NaF,0.032 g/L CaCl2,2.1 g/L hypoxanthine and 0.2 g/L MnSO4.The yield of inosine was 5.38 times higher than that of the control group.

Bacillussubtilis；CICC20958；inosine；accelerator；uniform design

2013-09-17

[修回日期]2013-12-18 [基金项目]福建省自然科学基金资助项目(2011J01225);集美大学中青年创新团队专项基金项目(2010A006)

游洪燕 (1989—) ,女,硕士生,从事发酵工程方向研究.通讯作者：杨秋明(1977—) ,男,高级实验师,从事微生物方向研究,E-mail ：yangqm@jmu.edu.cn.

1007-7405(2014)02-0107-06

Q 936

A