利用大孔树脂吸附法分离儿茶素EGCG和咖啡因

王瑞芳，陈发河，吴光斌，谢远红

(集美大学生物工程学院，福建厦门361021)

0 引言

研究表明，儿茶素EGCG具有显著的抗氧化性，有助于抗癌、抗诱变、抑制肿瘤、抗病毒、降脂助消化等作用［1-6］.干茶叶中约含20%的儿茶素，3%左右的咖啡因［7］.在儿茶素的提取过程中，咖啡因也同时被提取出来，咖啡因会刺激中枢神经、增加血压、提高类风湿关节炎的患病率等，因此，儿茶素和咖啡因的分离研究备受关注.目前，儿茶素和咖啡因的分离主要是采用有机溶剂萃取［8］和金属离子沉淀法［9］，但这两种方法对操作的安全性要求较高，且对环境易造成较大影响.研究者对大孔吸附树脂法分离儿茶素和咖啡因已做了大量研究，并筛选出具有较好层析分离效果的吸附树脂［10-11］.但他们大多选择对儿茶素具有较高吸附容量的吸附树脂，先把儿茶素吸附 (咖啡因通常也被吸附)，再通过一般洗脱或梯度洗脱的方法将儿茶素和咖啡因分离［12-13］.由于茶叶提取液中儿茶素含量较高，而咖啡因含量较低，本文拟选择一种对咖啡因具有较高吸附选择性的树脂，在吸附过程中能将低含量组分咖啡因吸附，而儿茶素流出，达到分离的目的.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

绿茶，产地福建;儿茶素EGCG对照品 (质量分数为95%)、咖啡因对照品 (质量分数为98%)均为Sigma公司产品;甲醇 (色谱纯);S-8、X-5、XAD-200大孔吸附树脂由南开大学化工厂提供.

1.2 仪器与设备

Angilent 1100高效液相色谱仪;自动进样器;紫外监测器 (Angilent);DT-100A型分析天平(北京光学仪器厂);THZ88-1台式多用恒温振荡器 (江苏太仓生化仪器厂);HL-2恒流泵 (上海沪西仪器厂);BSZ-2自动分部收集器 (上海沪西仪器厂);真空干燥箱 (天津实验仪器厂).

1.3 预处理

儿茶素EGCG和咖啡因含量的HPLC测定、供试液的制备方法、树脂预处理方法参见文献 ［13］.

1.4 静态吸附、解吸试验

称取1 g湿树脂直接加入50 mL具塞锥形瓶中，再加10 mL供试溶液，塞紧瓶口后置恒温振荡器中，25℃振荡 (140 r/min)吸附24 h后取样，然后过滤，少量水快速漂洗，再将树脂全部转移至另一干净干燥锥形瓶中，加10 mL体积分数为50%的乙醇水溶液，塞紧瓶口后置恒温振荡器中，25℃振荡 (140 r/min)解吸24 h后取样.HPLC法测定供试液、吸附残液、解吸液中的儿茶素EGCG和咖啡因的含量，相关参数的计算公式:

其中:C0为供试液中溶质的质量浓度 (mg/mL);C1为吸附残液中溶质的质量浓度 (mg/mL);C2为解吸液中溶质的质量浓度 (mg/mL);V1为供试液体积 (mL);V2为解吸液体积 (mL);W为树脂湿重 (g);x为树脂含水量;m为吸附量 (mg/g).

1.5 动态吸附试验

40 mL XAD-200湿树脂装入内径1.5 cm交换柱，样品液以1 BV/h上柱，流出液分部收集，同时对流出液进行HPLC检测.

2 结果与分析

2.1 标准工作曲线

分别精确称取儿茶素EGCG和咖啡因的对照品20 mg和6 mg，置10 mL容量瓶中，加体积分数70%乙醇至刻度，混匀.分别自动进样5、10、15、20、25、30 μL，测定高效液相色谱，其HPLC图谱如图1所示，其中，儿茶素EGCG的保留时间为19.218 min，咖啡因的保留时间为18.181 min.以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得出标准曲线方程，EGCG:Y=8.91909 X-198.19052，R=0.99985;咖啡因:Y=14.5217 X-535.35714，R=0.99978.计算结果显示，在检测范围线性均良好，EGCG及咖啡因的定量计算均以标准曲线为计算依据.

图1 儿茶素EGCG对照品（A）和咖啡因对照品（B）的HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of EGCG（A）and Caffeine（B）

2.2 静态吸附、解吸性能的比较

考察了3种不同类型的吸附树脂对绿茶提取液中咖啡因和儿茶素EGCG的吸附、解吸性能，计算结果列于表1.

表1 静态吸附、解吸结果Tab.1 Results of static adsorption and desorption

由表1可知:比表面积最大的XAD-200对咖啡因和EGCG的吸附量最大，随着比表面积的增大，树脂对咖啡因的吸附量也相应增加，这也许是由于3种树脂均为弱极性或非极性树脂，主要以表面物理吸附为主，所以比表面积成为影响吸附量的关键因素.而对EGCG的吸附，S-8、XAD-200的吸附量均高于X-5，这可能是因为EGCG分子中含有多个酚羟基，可与弱极性、中极性树脂中的极性基团之间产生附加的静电亲和力，因而对EGCG的吸附量有所增加.XAD-200对咖啡因的吸附平衡常数远大于儿茶素EGCG的，说明该树脂对咖啡因的吸附选择性远大于儿茶素EGCG，利用XAD-200对两者较大的吸附差异有可能将两者有效层析分离.采用体积分数50%乙醇水溶液解吸，EGCG和咖啡因的静态解吸率约为90%左右，解吸效果较好，利于树脂再生.综合考虑吸附选择性和解吸效果，认为XAD-200是一种较为理想的儿茶素脱咖啡因的分离介质.

2.3 动态吸附泄露曲线

图2 绿茶提取物在XAD-200上的动态吸附曲线Fig.2 Dynamic adsorption curve on XAD-200 resin of green tea extract

静态实验结果表明，XAD-200树脂适用于儿茶素和咖啡因的层析分离，故进一步测定了该树脂的动态吸附泄露曲线 (见图2).由图2可知，XAD-200对咖啡因的吸附选择性较大，儿茶素EGCG在1.5 BV后就开始泄漏，并很快达到吸附饱和，咖啡因在6 BV后才开始泄漏，单独收集1.5～6 BV间的流出液可得到低咖啡因含量的儿茶素.HPLC图谱见图3，图3显示，经XAD-200树脂柱层析分离，咖啡因的吸收峰 (保留时间18.389 min)已明显缩小，儿茶素EGCG(保留时间19.815 min)在吸附过程中流出.

2.4 吸附层析分离结果

供试液中EGCG和咖啡因的质量分数分别为48.65%、6.37%，XAD-200树脂吸附流出液 (单独收集1.5～6 BV间的流出液)中，咖啡因质量分数降至0.27%，且 EGCG质量分数提高至66.37%，说明吸附过程中部分色素也被除去 (被树脂吸附).

吸附完毕，用体积分数为50%的乙醇水溶液淋洗，吸附在树脂上的EGCG和咖啡因同时被淋洗下来，洗脱液回收，树脂再生完毕可多次重复使用.考察了上柱液量对儿茶素EGCG吸附层析分离效果的影响，其结果见表2.

表2 吸附层析分离效果Tab.2 Results of dynamic adsorption and separation%

由表2可知，上柱液量对EGCG的收率影响较大，上样量6 BV时收率最高，即咖啡因刚开始泄露即停止上样为最佳.上样量较少时，EGCG被吸附在树脂上，故收率低;上样量较大时，会出现咖啡因和EGCG同时泄露，后面收集的样品只能回收，故EGCG的收率也会下降.上柱液量超过6 BV后，收集液中EGCG的质量分数相差不大，咖啡因的质量分数均在0.30%以内.

3 结论

1)具有高比表面积的弱极性吸附树脂XAD-200对咖啡因和儿茶素EGCG吸附容量较大.

2)该树脂对咖啡因的吸附平衡常数远大于儿茶素EGCG，显示出对咖啡因具有较高的吸附选择性，利用这一性能，可用于儿茶素脱咖啡因.

3)在动态吸附过程中，儿茶素优先泄漏，咖啡因被树脂吸附，单独收集此流出液可得儿茶素流分，EGCG的质量分数由48.65%提高至66.00%以上，咖啡因的质量分数降至0.30%以下，最佳上样量 (6 BV)下，EGCG收率可达65.21%.

4)树脂法脱咖啡因，工艺操作简单，能耗低，避免大量有毒有机溶剂的使用，利于提高儿茶素产品的整体品质.

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