pH对坛紫菜丝状体光合速率和无机碳利用的短时效应

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(集美大学水产学院，福建 厦门 361021)

0 引言

大型海藻光合固碳的碳源来自海水。海水中溶解的无机碳以3种形式存在，即HCO3-、CO32-及CO2。正常海水(pH=8)中，HCO3-浓度约占总无机碳的92%，CO32-约占7%，CO2约占1%[1-2]。三种无机碳中，只有HCO3-和CO2是海藻可以直接吸收利用的碳源，但这两种无机碳的理化性质限制了藻类对二者的获取：CO2是小分子，通过细胞膜上的蛋白通道扩散进入细胞，但其浓度低，在海水中的扩散速度比空气中慢一万倍，导致藻类周围的CO2消耗完后无法得到有效补充；HCO3-是海水中无机碳的主要组分，但它是阴离子，不易穿过细胞膜，藻类需要消耗能量来主动获取[1,3-5]。因此，海水的CO2浓度远低于光合固碳的关键酶——核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(rubisco)的CO2半饱和点，藻类通过CO2浓缩机制(CO2concentrating mechanism，CCM)避免光合固碳受限于海水中CO2的浓度([CO2])。因此，CCM是藻类光合固碳的核心机制，坛紫菜等红藻也具有CCM[1,3,6]。

对模式真核藻类莱茵衣藻的CCM研究发现，莱茵衣藻主要有3条无机碳吸收途径[3]。细胞通过细胞膜上的CO2通道蛋白吸收海水中的CO2。而HCO3-的吸收利用有2个途径：1)海水中的HCO3-被位于周质空间的胞外碳酸酐酶(CA)催化生成CO2，经CO2通道蛋白进入细胞，最终被用于光合固碳；2)海水中的HCO3-经HCO3-转运蛋白进入细胞，经细胞内CA催化HCO3-生成CO2，然后CO2被用于光合固碳。紫菜也是真核生物，具有特殊的异型世代交替，主要分为单倍体的叶状体世代和双倍体的丝状体世代。以往的研究发现坛紫菜的叶状体世代的碳源主要是海水中的HCO3-，通过胞外CA催化HCO3-脱水生成CO2供给光合固碳[7-8]。通过阴离子转运蛋白抑制剂发现，条斑紫菜的自由丝状体主要通过HCO3-转运蛋白来获得外界HCO3-[9]。目前还没有报道坛紫菜丝状体CCM的研究，因此对其无机碳吸收途径还不清楚。

1 材料与方法

1.1 实验材料和pH梯度

本研究所用的实验材料是坛紫菜杂交品系Z-61的丝状体，在坛紫菜种质资源库中保种达12年之久。随机测定种质资源库中保种丝状体的pH值，发现其值为(8.8±0.6)(n=17)，说明丝状体长期在偏碱性的海水中生长。用天然海水配置的PES(provasoli’s enrichment solution )培养基培养丝状体，培养温度为21 ℃，光照强度60 μmol/(m2·s)，光照周期12 L∶12 D，充空气培养，每2天更换1次培养基。用无菌金属漏网收集丝状体，然后转移到pH不同的海水中培养4 h。本研究共设置4个pH梯度：6、7、8、9，用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH调节海水pH，每个梯度设3个重复。

1.2 实时荧光定量PCR

过滤收集坛紫菜丝状体约0.1 g，用滤纸吸干水分，在液氮中研磨后，用E.Z.N.A 植物 RNA 提取试剂盒(OMEGA，德国)提取总RNA。根据基因序列设计qPCR正反向引物，分析基因在不同pH处理下的表达差异。提取的总RNA按PrimeScript RT reagent kit(TaKaRa，大连)的说明书进行操作。25 μL的反应体系包含：12.5 μL 2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)，0.2 μmol/L引物和2 μL反转录产物。扩增程序为95 ℃变性1 min；95 ℃处理10 s，62 ℃处理30 s，共40个循环。循环结束后从55 ℃缓慢升温至95 ℃，然后绘制溶解曲线。荧光定量PCR扩增在ABI7300型定量PCR仪上进行，以10 × 梯度稀释的cDNA为模板进行定量PCR扩增，制作标准曲线。每次反应都设置阴性对照和无模板对照，每个反应设3个平行复孔。本研究中基因表达水平定量分析所采用的引物由大连宝生物工程有限公司合成，引物名称和序列如表1所示。

表1 实验中所用引物的名称和序列

1.3 光响应曲线

使用8个不同强度(166,607,1267,1795,2724,3395,4934，6578 μmol·m-2·s-1)、持续时间为10 s的光化光来测定快速光响应曲线，测定仪器为Diving-PAM(德国)。相对电子传递速率(rETR)的计算公式为：rETR=yield×0.84×0.5×PAR，其中，yield为光系统Ⅱ的有效光化学效率，0.84为固定常数，0.5代表约50%被吸收的光能分配到光系统Ⅱ，PAR则为光化光的强度。快速光响应曲线拟合公式为：ETR=ETRmax×tanh(α×PAR/Pmax)，其中，ETRmax为ETR的最大值，PAR则为光化光的强度，α为光限制部分的初始斜率。

1.4 光合速率和呼吸速率测定

1.5 数据分析

采用单因素方差(one-way ANOVA，LSD)分析采用不同pH处理的组间差异，P>0.05为差异不显著；P<0.05为显著差异。

2 结果

2.1 光合作用和呼吸作用

坛紫菜Z-61丝状体的净光合速率明显随着pH降低而显著增加(P<0.01)，3个低pH导致净光合速率至少增加了74%(见图1)。在不同pH下，抑制剂对净光合速率的影响差异较大。在保种条件下(pH=9)，AZ和EZ对净光合速率的抑制率达到80%，远高于DIDS的抑制率(见图2)，这说明坛紫菜丝状体在保种条件下主要通过胞外碳酸酐酶来获取无机碳，其次是HCO3-转运蛋白，而胞内碳酸酐酶的贡献较小。不同pH下，DIDS的抑制率稳定在40%以下，并且不同pH的影响较小。而EZ的抑制率随pH降低而显著降低，这说明丝状体直接获取的CO2随pH降低/[CO2]增加而增加。在pH=6下，AZ和EZ对净光合速率的抑制率的差异较大，说明胞内碳酸酐酶对光合速率的贡献较大，达到54%，显著高于pH=9时(P<0.001)。

但是，通过快速光曲线的测定发现，降低pH显著影响了rETR(见图3)，rETRmax(最大相对电子传递速率，maximal rETR)、Ik(光饱和点，the light saturation point)和η(表观光化学效率，the apparent photo chemical offciency)都随着pH降低而显著降低(见表2)。说明Z-61丝状体的光系统Ⅱ受到了短期pH处理的负面影响，当[CO2]增加降低了对光的需求。而坛紫菜丝状体的呼吸作用也随pH降低有下降的趋势，其中，pH=6下的呼吸速率显著低于pH=9(见图4)。说明低pH影响了呼吸速率的正常进行。

表2 快速光曲线拟合出的3个参数

pHrETRmaxIkη667．5±5．9a632．9±14．8a0．11±0．00a788．2±11．1ab502．9±91．5a0．18±0．01b8102．8±4．4b538．0±59．8a0．19±0．01bc9180．2±24．3c872．6±102．6b0．21±0．02c

说明：上标无相同字母表示显著差异。Note：Superscripts represent significant difference among treatments.

2.2 低pH对基因表达的影响

不同的pH对4条碳酸酐酶基因的作用各不相同(见图5)。

当pH值降到7和8时仅显著降低PhβCA1的表达(P<0.05)。而pH=6则显著降低PhβCA1和PhβCA2的表达水平(P<0.05)，却对PhβCA3和PhγCA1的影响不明显(P>0.05)。

pH降低显著降低了6条光合固碳关键酶基因的表达水平(见图6)，特别是pH=6导致PhRubisco、PhcpFBP、PhcFBP、PhSBP、PhPEPC和PhPEPCK的表达水平分别降低了85%以上(P<0.05)。而pH=8仅降低了PhPEPCK、PhcFBP和PhRubisco的表达，降低幅度分别达到93%、61%和88%(P<0.05)。

3 讨论

本研究还发现，经过长达12年的高pH/低[CO2]处理，坛紫菜Z-61丝状体依然能在生理和分子水平快速响应海水[CO2]的大幅度升高。一些海洋微藻经过几百代(约2年)的高[CO2]适应后，其光合作用和生长速率等都受到明显影响，特别是其无机碳吸收利用机制进化成适应高[CO2]状态[12]。钙化浮游植物颗石藻(Emilianiahuxleyi)在高[CO2](1000～2000 ppmv)下适应500代后，生长速率比未经过适应的明显提高，但钙化速率明显降低[16]。CCM在物种间和不同品系间的异同反应了各个物种和品系对无机碳的适应，最终表现在无机碳的吸收利用上[1,3]。而海藻的不同品系对环境[CO2]变化的适应能力不同，决定了他们在群体中的比例[11]。坛紫菜丝状体对海水[CO2]的快速响应能力，以及高[CO2]对丝状体光合作用的促进作用，说明坛紫菜丝状体将受益于大气[CO2]升高。同样坛紫菜叶状体的生长和光合作用也受益于[CO2]升高/pH降低。随大气[CO2]升高，坛紫菜的育苗和养殖都将受益于高[CO2]，野生坛紫菜因而可能在潮间带生态系统中获得更多竞争优势。

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