RT－PCR检测草鱼呼肠孤病毒的方法研究

郝贵杰，盛鹏程，林 锋，潘晓艺，徐 洋，姚嘉赟，尹文林，曹 铮，袁雪梅，蔺凌云，沈锦玉

(1．浙江省淡水水产研究所，浙江 湖州 313001;2．宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315211)

0 引言

草鱼是我国淡水养殖的四大家鱼之一，其主要疾病——草鱼出血病能够引起草鱼大批死亡，严重影响我国淡水养殖业的健康发展，其病原为草鱼呼肠孤病毒 (grass carp reovirus，GCRV)．GCRV为呼肠孤病毒科水生呼肠孤病毒属成员中毒力最强的病毒[1]．该病流行于我国各地养殖区，死亡率可达50%～80%，每年可造成数万吨草鱼产量的损失，严重影响我国草鱼养殖业的健康发展．目前对于该病毒还没有特效的治疗方法，早期快速诊断草鱼GCRV是目前草鱼养殖的主要预防措施和减少草鱼损失的有效途径．经典的草鱼呼肠孤病毒 (GCRV)检测方法包括用细胞系进行扩增分离、纯化病毒检测、电镜观察，但这些方法既费力又耗时．随着技术的发展，出现了其他的检测方法，如免疫酶染色法[2]、葡萄球菌协同凝集反应[3]及酶联免疫吸附测定法[4]，然而这些方法都有其局限性．

多聚酶链式反应PCR(polymerase chain reaction)是一种在20世纪90年代开始被广泛使用的体外核酸扩增技术，此法操作简便，可短时间内在微量离心管中获得数百万特异DNA序列的拷贝，目前，该技术己渗透到分子生物学的各个领域．在水生动物病毒病原检测方面，也有多个报道[5－7]，早在1997年王铁辉等[8]建立了检测GCRV的RT－PCR方法，李军等[9]也用该方法检测了病毒攻毒后病鱼组织中的病毒，但是他们的这个方法只能检测草鱼呼肠孤病毒的一株病毒，即GCRV－861．2004年，Seng等[10]报道了在水生呼肠孤病毒S6基因片段的保守区设计了一对兼并引物并建立了RT－PCR方法检测水生呼肠孤病毒，取得了较好的结果．本试验根据GenBank已发表的GCRV及其他水生呼肠孤病毒的第六基因片段，在保守区设计了一对GCRV特异性引物，以期建立一种快速、简便、灵敏及广谱的检测草鱼呼肠孤病毒的RT－PCR的方法，为草鱼GCRV的快速诊断、病原调查及常规检测提供技术支撑．

1 材料与方法

1.1 材料

1)毒株及细胞来源 试验选用一株已完成全部基因组序列测定的草鱼呼肠孤病毒作为标准参考株，草鱼肾细胞系[11](CIK)由长江所惠赠．

2)工具酶和试剂 Taq酶、dNTP、反转录酶 (AMV)、RNase抑制剂均购自大连宝生物工程有限公司，Trizol、DEPC、DMEM培养基为Sigma公司产品，PCR纯化试剂盒为爱思进生物技术有限公司产品，小牛血清购自杭州四季青公司，其他试剂为分析纯．引物合成在invitrogen(上海)英骏生物技术有限公司完成．

1.2 方法

1)细胞培养及病毒传代 ①细胞传代:把已长成致密单层的草鱼CIK细胞系，用0.25%(质量分数)胰蛋白酶和0.02%(质量分数)乙二胺四乙酸二钠混合消化液消化约5 min，然后倒掉消化液，再加入细胞生长液，用吸管吹打分散细胞，最后分装细胞瓶 (3 cm×6 cm)，使细胞传代接种量为2.5×105·mL－1，待细胞基本长满单层时用于病毒接种．②病毒传代:将病毒培养液反复冻融3次，冻融液按5%(体积分数)的比例接种于已长成单层的CIK细胞，28℃孵育1 h后倒去病毒液，然后加入维持液 (含2%(体积分数)小牛血清的DMEM培养液)继续培养，并设不接毒的CIK细胞作为阴性对照．24 h后开始观察细胞病变 (CPE)，CPE出现80%(体积分数)以上时收获．

2)引物设计 参照文献 [10，12]，在GCRV第6基因片段设计一对特异性引物:P1，5'-ATC-CCGTATATCTATGGCTT－3';P2，5'-TTGGAGACGAACATAGACGC-3'，预期片段436 bp．

3)组织及细胞感染病毒RNA的提取及RT反应 参照文献 [12－13]的方法进行．

4)PCR反应体系的优化 ①引物浓度的优化 PCR反应体系总体积为50μL:10×PCR Buffer(含Mg2+)5.0 μL，dNTP 4 μL，Taq DNA聚合酶2.5 U，上下游引物终浓度分别为1、40、80、120、160、200 nmol/L，反转录模板1.0 μL，最后用双蒸水补足余下体积．反应条件:95℃预变性4 min，94℃变性50 s，52℃退火50 s，72℃延伸50 s，共进行33个循环，最后再72℃延伸10 min，12℃保存．以1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测．②退火温度的优化 PCR反应体系同①．反应程序:95℃预变性4 min;其循环参数为94℃变性50 s，分别于56、54、52、50、48℃退火50 s，72℃延伸50 s，共进行33个循环;最后再72℃延伸10 min，12℃保存．PCR产物以1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测．

5)特异性试验 分别选取嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)BSK－10、WSSV、正常细胞作为测试对象，应用建立的RT－PCR方法进行PCR扩增，以测定其特异性．

6)敏感性试验 根据5)中的方法制备细胞培养病毒液的RNA并反转录，然后将cDNA模板作5倍倍比稀释，取不同稀释度的模板DNA各1 μL分别进行PCR扩增．

7)在养殖草鱼病害检测中的应用 分别在2007年和2008年在草鱼出血病流行季节，从江西莲塘鱼种养殖地及湖州郊区采集病鱼共5份，按3)的方法提取病鱼肝脾肾组织中的病毒RNA，用4)的RT－PCR方法进行检测，并结合细胞分离及理化特性鉴定进行验证．

8)病毒分离 参照文献 [14]的方法进行，用CIK细胞系进行病毒培养与分离．

9)病毒的鉴定 将细胞分离培养的病毒进行差速及超速离心、纯化，负染后进行电镜观察、拍照．参照文献[13]的方法进行测定，分别取一定量的病毒培养液，按一定比例加入乙醚或氯仿，经过处理后，测定处理组和对照组病毒液的组织细胞半数感染量 (TCID50)．

2 结果

2.1 RNA提取

采用分光光度计测定所提取样品的总RNA OD260/OD280的比值，均在1.8～2.0之间，这表明，所提取的总RNA中无蛋白质和氛类物质的干扰，其纯度较高，可以达到检测要求的纯度．

2.2 RT－PCR反应体系的优化

2.2.1 引物浓度的优化

按6种不同引物浓度，采用GCRV参考标准株核酸的反转录模板进行PCR扩增，结果如图1所示．上下游引物浓度分别为120 nmol/L和120 nmol/L时扩增效果最佳．

2.2.2 退火温度的优化

根据所设计引物的特点，设计了5个退火温度，其电泳结果如图2所示，可以看出，退火温度在50℃、52℃和54℃时，目的基因得到有效扩增，由于52℃时，扩增条带最为清晰，因此选52℃为优化后的退火温度．

2.3 RT－PCR的特异性

提取本实验室保存的嗜水气单胞菌BSK－10、WSSV的核酸、GCRV标准参考株及正常CIK细胞的RNA并进行反转录获得cDNA，分别作为PCR扩增的模板，以测定PCR引物的特异性．PCR体系和条件参照方法4)的优化结果．扩增结果如图3所示，结果表明该对引物特异性很好．

2.4 RT－PCR的敏感性

将GCRV的反转录模板作5倍倍比稀释，当稀释至5－7时，PCR结果还为阳性，结果见图4．

图1 不同引物浓度的PCR扩增结果Fig.1 PCR results using different primers concentration

图2 不同退火温度的PCR扩增结果Fig.2 PCR results under different annealing

图3 特异性试验结果Fig.3 PCR specificity test

图4 敏感性试验结果Fig.4 PCR sensitivity test

图5RT-PCR检测结果Fig.5 The results of RT-PCR detection

2.5 疑似GCRV感染草鱼病样的检测

用本RT－PCR方法对江西莲塘鱼种养殖地及湖州郊区采集的1份病鱼样 (肝、脾、肾)的研磨匀浆进行检测，结果 (见图5)有3份样品 (分别为JX2007、JX2008和HZ2008)在436 bp处有1条带，显示GCRV结果为阳性;2份为阴性 (分别为HZ07和HZ08)．

2.6 病毒分离培养结果

将采集到的疑似GCRV感染草鱼的5份病样，接种CIK细胞，RT－PCR检测结果 (见图6)为阳性的样品均在病毒感染单层细胞后24～36 h，细胞开始出现病变，病变形态和文献[14]的描述一致．

2.7 细胞培养病毒的RT－PCR检测结果

将CIK细胞分离为阳性的病毒样品，按照方法3)提取培养细胞总RNA，用所建立的RT－PCR方法进行检测，结果如图7所示．

2.8 病毒鉴定结果

在电子显微镜下观察到，提纯的病毒颗粒大小均一、近似球形、二十面体，直径约75 nm(见图8)，是呼肠孤病毒的特征．

图6 病毒感染细胞病变结果Fig.6 The CPE result of CIK cells infected by virus

图7 细胞培养病毒RT-PCR检测结果Fig.7 RT-PCR detection of virus in CIK cells

图8 提纯的病毒颗粒 （120 000×）Fig.8 The purified virus particles

3株分离株对氯仿、乙醚的敏感性试验结果见表1．结果表明:氯仿、乙醚处理组病毒的平均组织细胞半数感染量 (TCID50)变化不大，即病毒的感染力和对照组相比并没有多大变化，说明所分离的病毒对氯仿和乙醚有一定的抗性．

表1 氯仿、乙醚对3株分离株的影响Tab．1 Effects of chloroform and ether on three virus isolates

3 讨论

本研究参考了文献 [12]，并参考Genbank中的GCRV序列，在其S6基因片段保守区设计了一对特异性扩增GCRV的引物，建立了RT－PCR技术．用RT－PCR检测RNA的过程中，不但RNA的抽提方法对结果有影响，所选择的退火温度、引物浓度等对其结果也均有影响．通过优化PCR体系，得出最适的上下游引物浓度分别为120 nmol/L和120 nmol/L，最佳的退火温度为52℃．特异性实验表明，分别用所提取本实验室保存的嗜水气单胞菌BSK－10、WSSV的核酸、GCRV标准参考株及正常CIK细胞的RNA进行反转录获得cDNA，作为PCR扩增的模板，结果只有GCRV阳性有特异条带，其他全无特异性条带，这说明所设计的该对引物特异性很好．敏感性实验表明，将GCRV的反转录模板作5倍倍比稀释，当稀释至5－7时 (dsRNA为9×10－8μg时)，PCR结果还为阳性，说明敏感性较好．针对草鱼出血病进行病原检测，最快可以在8 h内完成实验，从发病草鱼样品中确诊GCRV病原．利用所建立的RT－PCR方法共检测了5份疑似样品，结果有3份为阳性，2份为阴性．为了进一步验证该方法的准确性，本试验采用CIK细胞分离的方法对所采5份病样进行了病毒分离，其中RT－PCR鉴定为阳性的病样滤液在感染单层细胞后24 h，细胞开始出现病变，病变过程和标准参考株病变一致[14]．进一步提取感染病毒细胞液的RNA进行RT－PCR，也全部为阳性．从纯化病毒的电镜观察及理化特性分析结果可以看出，氯仿、乙醚处理组病毒的感染力和对照组相比变化不大，说明所分离的3株病毒对氯仿和乙醚有一定的抗性．这种理化特性可作为此病毒不存在囊膜的证据，该结果与柯丽华等[15]报道的一致．

综上所述，本试验建立了一种快速、简便、灵敏的检测草鱼呼肠孤病毒的RT－PCR的方法．体内外研究都表明，该方法与传统的方法相比，具有灵敏性和特异性好并且耗时少的特点，而且和以往的草鱼呼肠孤病毒的RT－PCR方法比较，具有较好的光谱性．因此，该方法的建立为草鱼呼肠孤病毒的快速诊断、病原调查及常规检测提供了技术支撑．

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