利用柚皮高效发酵生产柚苷酶的研究

郭小红，刘艳苓，姜泽东，2，3，李利君，2，3，朱艳冰，2，3，倪辉，2，3，蔡慧农，2，3

（1.集美大学食品与生物工程学院，福建厦门 361021；2.福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门 361021；3.厦门市食品与生物工程技术研究中心，福建厦门 361021）

利用柚皮高效发酵生产柚苷酶的研究

郭小红1，刘艳苓1，姜泽东1，2，3，李利君1，2，3，朱艳冰1，2，3，倪辉1，2，3，蔡慧农1，2，3

（1.集美大学食品与生物工程学院，福建厦门 361021；2.福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门 361021；3.厦门市食品与生物工程技术研究中心，福建厦门 361021）

以棘孢曲霉为菌种，以磷酸氢二铵为氮源固态发酵柚皮生产柚苷酶，结果表明，在以柚皮为碳源和磷酸氢二铵为氮源的发酵体系中，添加疏松剂和豆饼粉对柚苷酶发酵没有显著影响，而磷酸氢二铵添加量和水分质量分数对柚苷酶合成具有显著影响.当无水柚皮粉中磷酸氢二铵和水分质量分数分别为32.4%和170.0%时，有利于提高柚苷酶发酵活力.在接种量为7.1%、发酵温度为30℃的情况下发酵6 d，柚苷酶比合成速率与棘孢曲霉的生长速率符合模型Y柚苷酶＝6.2677X-0．0381，其中Y代表柚苷酶的比合成速率，X代表比生长速率.用Davis法测得柚苷酶活力为94.61 IU／g，酶发酵的培养基成本（5×10-5元／IU）远远低于其他同类研究，酶的纯度远高于用豆饼粉为氮源所获得的酶纯度.

柚皮；柚苷酶；固态发酵；成本估算；比活力

0 引言

柑橘类水果是世界上最大宗的水果，无论是种植面积还是产量都远远大于其他种类的水果［1］，它不仅可以鲜食，还是果汁加工的主要原料.柑橘类水果经人们食用或加工后约产生40%的副产物，包括果皮和果渣［2］.因此，对柑橘加工副产物进行高值化利用是柑橘产业发展的重要研究领域.传统研究表明，柑橘加工副产物可用于提取果胶、膳食纤维、香精油和黄酮等［3］.近年研究表明，柑橘加工副产物也是发酵食品生产酶制剂的原料，如可以作为果胶酶和纤维素酶的良好原料［4-5］.

柚苷酶（EC 3.2.1.40）是α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶的复合酶，它不仅能将柑橘类水果中具有苦味的柚皮苷水解成柚皮素，达到脱苦的效果，还可用于改善酿造酒香味以及制备抗生素、鼠李糖和普鲁宁等活性物质［6-9］，是一种应用前景良好的新型酶制剂.相关研究表明，柑橘果皮中含有丰富的橙皮苷和柚皮苷，能作为柚苷酶的诱导物［10-12］.Puri等［13］发现，添加柚皮粉可以提高StaphylococcusxylosusMAK2产柚苷酶；Mendoza-Cal等［14］利用橙皮和柚皮作为发酵底物，优选出产柚苷酶的菌株和发酵条件；王迪等［15］和陈红等［16］发现用棘孢曲霉（Aspergillusaculeatus）固态发酵柚皮可高产柚苷酶.这些研究结果表明，作为柚苷酶发酵生产原料是柑橘加工副产物综合利用的一种新途径.

在前期研究［15-16］中，本实验室分离得到了一株高产柚苷酶的棘孢曲霉菌株，发现其在柑橘加工副产物中进行固态发酵可产生大量的柚苷酶.酶发酵需要大量氮源，相关研究［13，17］表明，采用豆饼粉、蛋白胨等有机氮源对柚苷酶合成具有促进作用.但是，有机氮源含有丰富蛋白质，加入到酶发酵体系中，将大大增加酶分离纯化的难度.最近，笔者发现，在固态发酵体系中，用磷酸氢二铵作为氮源也可以高产柚苷酶，与有机氮源相比，不会因为引入杂蛋白质而导致柚苷酶分离纯化困难的问题.因此，为进一步优化用磷酸氢二铵作为氮源的柑橘加工副产物固态发酵体系，进一步提高柚苷酶产量，本研究拟建立一种高产、高纯度的柚苷酶发酵生产技术，以柚子加工副产物柚皮为研究对象，对固水比、疏松剂、磷酸氢二铵和豆饼粉添加量进行优化，研究酶合成动力学，分析酶生产培养基成本及酶纯度，为柚苷酶的高效发酵及柑橘副产物的高值化利用提供试验依据.

1 材料与方法

1.1 原料与药品

原料：柚子外果皮由福建省国农农业发展有限公司提供，经50℃烘干、粉碎过40目筛备用.

药品：柚皮苷和柚皮素（纯度均≥98%）购于中国陕西小草植物科技有限责任公司；甲醇和乙腈（均为色谱纯）购于美国TEDIA公司；其他试剂（分析纯）均购于上海国药集团有限公司.

1.2 菌种与培养基

棘孢曲霉JMUdb058菌株［18］由集美大学生物工程学院发酵工程研究室选育保存.

斜面培养基［19］（g／L）：MgSO4·7H2O 1.0，KH2PO41.0，（NH4）2SO41.5，KCl0.5，KNO31.5，无水CaCl20.1，酵母膏2.0，柚皮苷2.69，琼脂20，初始pH＝6.0，121℃灭菌20 min.

固态发酵初始培养基：在柚皮粉（水分质量分数为7.4%）中加入磷酸氢二铵10%（质量分数），并加入与柚皮粉同质量的蒸馏水.

1.3 仪器设备

Waters 2695高效液相色谱分析仪和Symmetry C18反相柱（4.6 mm×150 mm，3.5μm）购于美国Waters有限公司；SHZ-IIID型循环水式多用真空泵购于上海亚荣生化仪器厂；ALP-高压蒸汽灭菌器购于日本ALP公司；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台购于苏州净化设备有限公司；数显恒温水浴锅购于常州国华电器有限公司；霉菌培养箱购于上海博迅实业有限公司医疗设备厂；pH211C酸度计购于北京哈纳科仪科技有限公司；UV-7200型可见分光光度计购于尤尼柯仪器有限公司；101-3B型电热鼓风干燥箱购于上海市实验仪器总厂.

1.4 实验方法

1.4.1 菌种活化及发酵操作

将4℃下贮藏的菌种接种于斜面培养基上，28℃下培养4 d得到成熟孢子，用0.75%（体积分数）无菌生理盐水洗下孢子，转移至装有50 mL无菌生理盐水和无菌玻璃珠的三角瓶中，将孢子充分打散后，用无菌生理盐水调整其OD600值至2.0（孢子1×108个／mL），即得孢子悬液.为了优化发酵培养基，进行以下试验：在250 mL三角瓶中装入用5 g柚皮粉加入其他成分配成的培养基，灭菌冷却后按照总装样量的7.1%接种上述孢子悬液，搅拌均匀后于30℃静置培养8 d.

1.4.2 加水量对柚皮固态发酵产酶的影响

保持发酵初始培养基的其他成分不变，分别按照柚皮粉与水的质量比为1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5和1∶3配制培养基，接种发酵后，测定酶活力、生物量以及还原糖含量.

1.4.3 疏松剂对柚皮固态发酵产酶的影响

以柚皮粉与水的质量比为1∶1.5的比例混合，分别加入以下3种成分配制培养基：（A）按柚皮粉质量的10%添加（NH4）2HPO4；（B）分别按柚皮粉质量的10%添加（NH4）2HPO4和麸皮；（C）分别按柚皮粉质量的10%添加（NH4）2HPO4和甘蔗渣.其中，A为对照，B为添加10%麸皮作为疏松剂的培养基，C为添加10%甘蔗渣为疏松剂的培养基.接种发酵后，分别测定酶活力、生物量以及还原糖含量.

1.4.4 磷酸氢二铵添加量对发酵产酶的影响

固定培养基中柚皮粉和水的质量比为1∶1.5，分别按照柚皮粉质量的0%、10%、20%、30%、40%和50%添加磷酸氢二铵，配制培养基，接种发酵后，分别测定酶活力、生物量以及还原糖含量.

1.4.5 豆饼粉添加量对发酵产酶的影响

固定每份培养基中添加柚皮粉质量的30%（NH4）2HPO4，以柚皮粉与水的质量比为1∶1.5的比例加水，分别按柚皮粉质量的0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%添加豆饼粉，配制培养基，接种发酵后，分别测定酶活力、生物量以及还原糖含量.

1.4.6 柚苷酶动态规律及酶合成动力学

采用优化后的培养基（在柚皮粉中加入30%（质量分数）磷酸氢二铵，并加入柚皮粉质量1.5倍的蒸馏水），接种发酵，每隔2 d取样一次，分别测定各样品的酶活力、生物量及还原糖含量，分析柚苷酶活性、生物量和还原糖含量随发酵时间变化的动态规律，计算比速率，并拟合柚苷酶合成及生长的关系动力模型.

1.4.7 柚苷酶活力测定

为了快速获得优化效果，在大部分试验中，参照Ni等［20］的液相色谱法（HPLC）测定柚苷酶活力.取样后，在每个发酵三角瓶中加入100 mL pH＝5.0的柠檬酸（0.01 mol／L）-磷酸氢二钠（0.02 mol／L）缓冲液，30℃、200 r／min振荡浸提1 h，用定性滤纸过滤，滤液经4℃、13000 r／min离心20 min即得粗酶液.取2 mL柚皮苷标准液（300μg／mL）与1.9 mL pH＝5.0缓冲液混合，50℃恒温保温15 min，加入0.1 mL粗酶液，50℃反应15 min，置于100℃加热30 min使酶失活，迅速冷却后过0.45μm滤膜，用HPLC测定反应液中柚皮苷和柚皮素含量的变化.空白对照以灭活的酶液代替酶溶液，其他方法条件相同.液相色谱条件为：流动相流速0.4 mL／min，柱温35℃，上样体积20μL，走样时间20 min，紫外检测波长280 nm，梯度洗脱程序见表1.根据柚皮素的生产量计算柚苷酶活力，酶活力单位（IU）定义为：在50℃、pH＝5.0的条件下，每分钟生成1μmol柚皮素所需柚苷酶的量定义为一个柚苷酶活力单位.

表1 用于柚苷酶活力检测的高效液相色谱流动相梯度Tab．1 Mobile phase com position and gradient formeasuring naringinase ac tivity

为了对比本研究和国内外同类研究的酶产量水平，在验证试验中，除HPLC法外，还参照Puri等［17］用Davis法测定柚苷酶活力，具体操作是：取0.9 mL 0.05%柚皮苷标准溶液（pH＝4.0醋酸-醋酸钠缓冲溶液）与100μL粗酶液混合均匀，置于50℃恒温箱保温60 min，迅速吸取100μL反应液并加入90%一缩二乙二醇5 mL、4 mol／LNaOH溶液100μL，摇匀后于28℃保温10 min，在420 nm下测定吸光度值.根据柚皮苷标准曲线计算反应后消耗的柚皮苷量，以此为依据计算柚苷酶活力，每个柚苷酶活力单位（IU）定义为在此反应体系下消耗1μmol柚皮苷所需的柚苷酶量.

1.4.8 生物量测定

参考魏培莲等［21］提供的方法测定氨基葡萄糖含量，用以计算固态发酵产物中的菌体量.称取干发酵样品0.300 g，加2 mL 60%H2SO4，25℃恒温箱浸泡24 h，加入28 mL蒸馏水稀释H2SO4至浓度为1 mol／L，置于250 mL三角瓶中，沸水浴加热1 h，冷却后用1 mol／LNaOH中和至pH＝7.0，定容至100 mL.取2 mL样液加1 mL乙酰丙酮试剂，沸水浴加热0.5 h，冷却后加入2 mL无水乙醇、1 m L对二氨基苯甲醛试剂振荡，再加入4 m L无水乙醇，60℃保温1 h，测定OD530，对照组将样液替换成水，根据菌体干重对氨基葡萄糖含量的标准曲线计算生物量.

1.4.9 还原糖含量测定

参考张龙翔等［22］的方法，取1 mL粗酶液用3，5-二硝基水杨酸比色法（DNS法）测定其中还原糖含量.

1.4.10 蛋白质含量测定

参考陈钧辉等［23］的考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，配制1 g／L的牛血清标准蛋白，分别取0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1 mL，加入蒸馏水至0.1 mL，再分别加入5 mL配制好的考马斯亮蓝G-250，震荡均匀后放置5 min，测定595 nm下的吸光度值.取0.1 mL样品，按上述方法测定吸光度值，根据标准曲线计算酶液中的蛋白质含量.

1.4.11 发酵产物SDS-PAGE蛋白质电泳

分别配制10%分离胶和5%浓缩胶，灌胶，待胶凝固后，取待测酶液30μL，加入4×SDS上样缓冲液10μL，混匀，沸水浴处理5 min，迅速冷却，离心后取12μL上清液加入到加样孔中，往电泳槽中倒入1×SDS缓冲液，在电流12 mA的条件下电泳120 min后进行银染显色.

1.5 数据处理与分析

试验数据取3次平行测定的平均值，应用Excel软件计算平均值和标准偏差，应用SPSS软件对结果进行差异显著性分析（P＜0.05）．

2 结果与分析

2.1 柚皮粉和水的比例对发酵产酶的影响

在固态发酵过程中，初始含水量是影响发酵成败的关键因素之一.据相关研究报道［24］，含水量过高，不仅会降低氧的扩散和交换，而且稀释了营养物质，从而影响菌体生长以及产酶；当含水量较低时，培养基中糖浓度较高，导致产生营养物阻遏并增大了培养基渗透压，也会影响微生物生长和产酶量.

图1显示，还原糖含量随水的比例增加而下降；生物量和柚苷酶活力随水的比例增加先增加后减少，当柚皮粉和水的质量比为1∶2.5时，生物量达到最大；当柚皮粉和水的质量比为1∶1.5时，柚苷酶活力达到最大.因此，在下面的试验中按柚皮粉和水1∶1.5的质量比加水.

2.2 疏松剂对发酵产酶的影响

柚皮中含有大量的果胶［25］，灭菌后容易导致培养基黏度增大及通透性降低而影响微生物生长.甘蔗渣和麸皮含有丰富的纤维素，能增加固态发酵培养基的疏松透气性，提高菌丝体生长［26］.在柚子果皮中添加一定量的甘蔗渣和麸皮（增加柚苷酶固态发酵培养基的通透性）进行发酵试验，结果（见图2）显示，添加麸皮和甘蔗渣后产酶量下降，生物量和还原糖含量变化不大.进一步进行方差分析发现，添加疏松剂后对产酶量、还原糖、生物量含量均没有显著性影响，出现该现象的可能原因是添加疏松剂后培养基总量增加，但柚皮粉在培养基中的含量降低了，营养物质降低与通气量增加的效应相互抵消.针对该现象，在后续发酵中不添加疏松剂.

图1柚皮粉和水的比例对柚苷酶固态发酵的影响Fig.1 Effectof citrus peel-water ratio on the solid-state fermentation ofnaringinase

图2添加疏松剂对柚苷酶固态发酵的影响Fig.2 Effectof loosening agents on solid-state fermentation ofnaringinase

2.3 磷酸氢二铵对发酵产酶的影响

前期研究［27］结果表明，以铵盐或尿素为氮源，可以消除葡萄糖、果糖和淀粉等对柚苷酶发酵的分解代谢阻遏作用，从而提高柚苷酶的发酵产量.考虑到铵盐利用后残留的磷酸盐可能影响培养基pH值，从而影响柚苷酶的发酵，因此，研究了磷酸氢二铵的添加量对柚苷酶固态发酵的影响.结果如图3所示，当磷酸氢二铵添加量从0增加到10%柚皮粉时，还原糖迅速降低，生物量大幅度上升，之后还原糖含量随磷酸氢二铵添加量增大趋于平稳，而生物量随添加量增大而降低.当磷酸氢二铵为30%柚皮粉时，柚苷酶活力达到最大，之后随着添加量的增大而减少.该现象可能是由于棘孢曲霉的生长及酶分泌所需的最适pH值不一致所引起的；当磷酸氢二铵添加量为10%柚皮粉时，其培养基的pH值最适合于微生物生长，此时营养物质大量用于生长菌体，体现出生物量最大，而酶活力不是最大；当磷酸氢二铵添加量为30%柚皮粉时，培养基的pH值最适于酶合成，营养物质大量流向酶蛋白合成，体现出生物量减小，而酶合成量最大.由于本研究是以提高柚苷酶产量为试验目的，因此后期试验添加磷酸氢二铵的量为30%柚皮粉.

2.4 豆饼对发酵产酶的影响

豆饼粉来源稳定，价格低廉，含有丰富的微量氨基酸、蛋白质、维生素等营养物质，是发酵工业中常用的氮源及生长因子.大量添加豆饼粉作为氮源，由于其中淀粉分解（产生葡萄糖）会对诱导酶产生阻遏［17，28］，但相关研究表明豆饼粉是柚苷酶发酵的良好氮源［13］，但添加豆饼粉会导致发酵产物中杂蛋白质含量偏高，影响对酶进行分离纯化.本研究采用磷酸氢二铵为氮源配制培养基，并在其中添加不同量豆饼粉进行发酵，结果显示，豆饼粉的添加量对生物量、还原糖含量和柚苷酶活力的影响不明显（见图4）.用SPSS 17.0软件进行方差分析，进一步证实了添加豆饼粉对生物量、还原糖含量和柚苷酶活力均无显著性影响.该结果与相关研究［13］报道在培养基中添加豆饼粉可以大幅度提高柚苷酶产量明显不同，原因主要有：1）磷酸氢二铵和豆饼粉都是柚苷酶发酵优良氮源，在培养基中含有充足磷酸氢二铵的情况下，再补充氮源豆饼粉已经没有必要；2）柑橘副产物中可能含有丰富的生长因子，不需要额外补充豆饼粉、蛋白胨等物质就能提供棘孢曲霉生长及其酶合成需要的生长因子.考虑到本研究柚皮粉含有7.4%的水分，因此优化培养基的组成为：在无水柚皮粉中添加32.4%的磷酸氢二铵和170%的水（此比例均为与无水柚皮粉的质量比）.

图3磷酸氢二铵添加量对柚苷酶固态发酵的影响Fig.3 Effectofaddition of(NH4)2HPO4on so lid-state fermentation ofnaringinase

图4豆饼粉添加量对柚苷酶固态发酵的影响Fig.4 Effectofaddition ofsoybeanmealon solid-state fermentation ofnaringinase

2.5 柚苷酶固态发酵的动态规律及酶合成动力学

如图5a所示，随发酵时间增加，还原糖含量逐渐降低，生物量和酶活性先快速增加后趋于平稳；生物量和酶活力曲线变化趋势高度一致，发酵6 d时，生物量和柚苷酶活性同时出现最大值.图5b显示，比生长速率X（以菌体干重的含量表征，单位为d-1）和柚苷酶的比合成速率Y（单位为IU／（g·d））随发酵时间的增加呈现同步降低趋势.进一步拟合柚苷酶比合成速率与棘孢曲霉比生长速率的关系，得到它们的回归关系模型为Y柚苷酶＝6.2677X-0.0381.该模型显示，棘孢曲霉柚苷酶的合成似乎符合部分生长关联型模型，每生长1 g的菌体就会合成约6.27 IU的柚苷酶，在菌体生长停止后，柚苷酶以0.038 IU／（g·d）的速度缓慢下降.进一步分析发现，0.0381仅相当于6.2677的0.61%，而图5a显示，菌体生物量与酶活力测定的误差均在5%左右，该分析结果说明0.0381这个数值可能是由于测量误差引起，而不是实际差异引起的，由此推测该柚苷酶合成属于生长关联型.相关研究［29］表明，产物合成生长关联型的特征是产物合成曲线与生长曲线高度一致.图5中棘孢曲霉生物量和柚苷酶活性曲线随时间变化趋势的高度一致性也进一步证明该柚苷酶合成属于生长关联型，该结果与陈红等［27］用豆饼粉为氮源研究的柚苷酶合成动力学规律相一致，但与张晨等［29］研究结论（B04菌株产柚苷酶的合成属于非生长关联型）不一致，其主要原因可能是菌株、发酵条件及发酵状态不同所致.

图5柚苷酶合成的动态规律及酶合成动力学分析Fig.5 Dynam ic process and kine tic analysis ofnaringinase during p roduction

2.6 用柚皮为碳源、磷酸氢二铵为氮源发酵柚苷酶的成本分析

目前，国内柚苷酶的研究都停留在实验室研究阶段，商品酶制剂在国内没有生产，市场上尚属空白.国外只有美国、日本等少数国家生产，价格昂贵，如2009年美国Sigma公司出品的柚苷酶制剂（酶活力约为300 U／g），价格为1623.9元／kg，日本田边制药生产的柚苷酶制剂（酶活力为150 U／g）售价高达2600元／kg，因此限制了柚苷酶在食品工业中的应用.本研究柚苷酶活力达到94.61 IU／g（用Davis法测定），高于Mendoza-Cal（2.58 U／mL）［14］、张晨等（342 U／mL）［29］报道的酶活力，同样高于用王迪［15］和陈红［16］的方法发酵所获得的柚苷酶活力（见表2）.计算柚苷酶发酵培养基成本，并与各报道提供的柚苷酶生产培养基成本进行对比，结果（见表2）显示，本研究生产柚苷酶的成本仅为5×10-5元／IU，远远低于本实验室前期研究［15-16］和国内同类研究［14，29-30］的生产培养基成本.

表2 柚苷酶生产成本估算Tab.2 Cost evaluation for naringinase production

2.7 用柚皮为碳源、磷酸氢二铵为氮源发酵柚苷酶的纯度分析

酶的纯度是影响酶工业化制备及应用的关键因素之一，发酵产物中酶的纯度越高，提纯应用的可能性也越高.由表3可得，添加磷酸氢二铵作为氮源，酶的比活力为16.47 IU／mg，远高于以豆饼粉为氮源所获得的比活力（7.01 IU／mg）.分别浸提以磷酸氢二铵和豆饼粉为氮源获得的粗酶液，稀释到相同的酶活性，进行SDS-PAGE电泳分析（见图6）发现，以豆饼粉为氮源的发酵产物中杂蛋白质明显比用磷酸氢二铵为氮源发酵的粗酶液多.这两个结果说明，用磷酸氢二铵为氮源发酵所获得的柚苷酶比用豆饼粉为氮源发酵的柚苷酶的纯度高，有利于进一步纯化利用.

图6不同粗酶液的SDS-PAGE图Fig.6 SDS-PAGE of different crude enzymes

表3 两种培养基对产柚苷酶的影响Tab.3 Com parison of two media for the production of naringinase byA．aculeatus

3 结论

1）初步优化获得以柚皮为碳源，磷酸氢二铵为氮源产柚苷酶的培养基为：在无水柚皮粉中添加质量分数32.4%磷酸氢二铵和170.0%的水.

2）用柚皮为碳源，磷酸氢二铵为氮源培养棘孢曲霉，柚苷酶合成符合模型Y柚苷酶＝6．2677X-0．0381，属于生长关联型.

3）用柚皮为碳源，磷酸氢二铵为氮源培养棘孢曲霉，柚苷酶活力与同类研究报道相当，酶发酵成本远远低于其他同类研究，酶纯度高于用豆饼粉为氮源所获柚苷酶的纯度.

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（责任编辑 马建华 英文审校 曹敏杰）

Utilization of Pomelo Peel for Effective Production of Naringinase During Solid-state Fermentation

GUO Xiao-hong1，LIU Yan-ling1，JIANG Ze-dong1，2，3，LILi-jun1，2，3，
ZHU Yan-bing1，2，3，NIHui1，2，3，CAIHui-nong1，2，3
（1.College of Food and Biological Engineering，Jimei University，Xiamen 361021，China；
2.Fujian Provincial Key Laboratory of Food Microbiology and Enzyme Engineering，Xiamen 361021，China；
3.Research Center of Food Biotechnology of Xiamen City，Xiamen 361021，China）

The naringinase production fromAspergillusaculeatuswas investigated using（NH4）2HPO4as nitrogen source in pomelo peel fermentation.The results showed thatnaringinase activity did not significantly increase by adding loosening agents and soybean meal powder，while the content of diammonium hydrogen phosphate and water had significant influence on naringinase production.The composition of the optimalmedium included anhydrous citrus peel powder，the percentage rates for other ingredients in anhydrous citrus peel powder were as follow：diammonium hydrogen phosphate，32.4%；water，170.0%.By using the fermentation condition of inoculum size7.1%and fermentation temperature 30℃，the naringinase fermentation was estimated to have a naringinase synthesismodelYnaringinase＝6.2677X-0．0381，whereYrepresented the enzymatic specific synthetic rate andXwas the specific growth rate.After fermentation for 6 days，naringinase activity attained 94.61 IU／g by Davismethod analysis，higher than most research before reported.In addi-tion，themedium cost wasmerely 5×10-5Yuan／IU naringinase，much lower than those previous studies. Furthermore，the enzyme extract revealed higher purity than that in our previous study.

pomelo peel；naringinase；solid-state fermentation；cost estimation；specific activity

S 216.2

A

1007-7405（2015）05-0356-09

2015-02-10

2015-04-02

国家自然科学基金资助项目（31271914）；福建省自然科学基金资助项目（2011J01225）；集美大学科研创新团队基金资助项目（2010A006）

郭小红（1990—），女，硕士生，从事食品生物技术研究.通信作者：蔡慧农（1957—），男，教授，主要从事食品生物技术研究，E-mail：huinongcai＠sina.com.cn.