组织工程和3D 生物打印下耳廓构建的研究进展

何蓓 章庆国

【提要】 小耳畸形是我国第二多见的先天性颅面部疾病，主要表现为耳廓发育不全，部分患者同时合并外耳道狭窄或闭锁、中耳畸形。多年来，耳廓再造因其复杂性和精细性一直是整形外科面临的巨大挑战。自体肋软骨移植和Medpor 支架植入是目前临床最常用的两种手术方式，但依旧存在各自的局限性。近年来，以组织工程和3D 打印技术为核心的耳廓构建模式取得了一定的研究成果，给未来小耳畸形的治疗提供了新的可能。

先天性小耳畸形是胚胎在耳廓发育期间受到遗传或外界因素影响最终出现外耳表现异常的疾病，常伴有外耳道狭窄或闭锁、中耳畸形和（或）颌面畸形，除了影响外观和功能外，也给患儿心理健康造成负面影响。手术是治疗小耳畸形的最佳手段，目前耳廓再造的手术方法主要是自体肋软骨移植和Medpor 支架植入，但现有材料和方法可能造成各种并发症。随着组织工程和3D 打印技术在再生医学领域的广泛研究和运用，有望构建出符合天然耳廓组织学、功能和形态的新型耳廓支架，为小耳畸形的治疗提供新的选择，以克服目前常用支架的不足。本文就耳廓再造中利用的主要材料，以及近年来以组织工程、3D 打印技术为基础进行的耳廓构建研究进行综述。

1 自体肋软骨和Medpor 支架

自体肋软骨具有来源丰富、组织相容性良好、耐压性强、无排斥反应等众多优点，是目前国内外耳廓再造手术的首选支架材料，主要通过手工雕刻成形后进行一期或多期植入。但该方法存在诸多不足，最显著的为供区相关并发症，最常见是供区疼痛，及其导致的呼吸变慢变浅，从而引起术后肺不张、肺部感染等[1]；另外还有供区瘢痕、气胸、胸廓畸形等[2-3]。目前，患儿的手术年龄受自体肋软骨发育情况限制[4]，且术中支架雕刻难度大，手术效果很大程度依赖于医生的经验与技术[5]。

1983 年，Berghaus 等[6]首次报道将多孔高密度聚乙烯运用在耳再造手术中。1984 年，Medopr 被正式批准可植入人体。Medpor 支架开放且互相交通的孔隙结构有利于修复部位的组织和血管向内生长，具有良好的组织相容性和结构稳定性[7]。该材料经过加热后具有优良的塑形性，已被广泛用于鼻整形、眼眶整形、口腔颌面重建和颅骨重塑[8-9]。Medpor 耳支架分为“C”形耳轮和“Y”形耳基两部分，组装好的支架可以通过颞浅筋膜瓣伴皮片移植Ⅰ期完成耳再造，或通过耳后皮肤扩张并或不并筋膜瓣覆盖Ⅱ期完成再造手术[10]。该支架的使用使手术不受自体肋软骨发育限制，手术平均年龄也可被适当提前[11]。该支架内部快速血管化保证了较强的抗感染能力，本身的惰性也增强了抗菌性。近年来，将该材料运用在扩张器期间耳后皮肤出现破溃感染[12]、烧伤性瘢痕耳[13]、部分耳廓缺损的修复[14]中也取得了不错的效果。虽然多年临床实践证明其排斥反应和远期吸收率都很低，但是该材料物理性质过硬、应力性能较差，支架外露导致感染的风险较大，往往需重新植皮修复。目前建议只有当肋软骨钙化严重或极不愿意使用自体肋软骨的情况下考虑使用Medpor 支架[15]。

2 组织工程耳廓构建

利用组织工程重建耳廓的理想情况是将具有成软骨能力的种子细胞和支架材料结合，构建出具有特定形态、组织及功能的人耳状软骨，植入体内修复缺陷[16]。耳组织工程的核心在于支架材料和种子细胞的选择。目前常用的支架材料根据来源可分为天然生物材料和人工合成材料，前者如胶原、透明质酸、藻酸盐、壳聚糖等，后者如聚羟基乙酸（Poly-glycolic acid，PGA）、聚乳酸（Poly-lactic acid，PLA）、聚己内酯（Poly-caprolactone，PCL）、聚氨酯（Polyurethane，PUR）等[17-19]。种子细胞需要具备取材方便、增殖分化能力强、与支架材料组织相容性良好以及生物安全等特点，软骨细胞和干细胞是耳组织工程研究中的主要细胞来源[20]。

2.1 软骨细胞-支架构建体

Zhao、Pomerantseva 等[21-22]分别尝试将绵羊耳软骨细胞接种在Ⅰ型胶原支架，前者观察到了丰富的Ⅱ型胶原、弹力纤维等软骨细胞外基质成分生成，并提出在植入体内之前有一个较长的体外动态培养时间更有利于预测支架的最终尺寸；而后者构成的耳形支架也获得了绵羊自体内培养的成功。种植了兔耳软骨细胞的PLA 支架、多孔PUR 人耳形支架[23-24]都在低免疫活性动物体内实现了成熟软骨组织的再生，并保持了完整的耳廓形状、良好的机械性能和热学稳定性。在对聚氨酯耳支架的进一步探索中发现，规则的孔径分布、合适的孔径大小和高孔隙率是提高细胞增殖率，胶原和血管组织填充的关键因素[25]。NaKao 等[26]将人残耳软骨细胞接种在纳米纤维PGA 支架上，得到了与正常耳软骨细胞来源几乎无异的软骨组织。刘戈等[27]验证了人残耳软骨细胞联合非降解PUR 支架用于修复耳廓组织缺损的可行性，同时发现体内环境比体外更利于软骨组织生成。

天然材料虽具有良好的生物相容性、可吸收性，但机械强度差、降解速度不稳定[28]。人工合成材料可以通过化学和物理变性而改变其生物和材料特性，具有较强的可塑性和机械性[29]，但其生物相容性大多不如天然生物材料，且降解产生的酸性物质会改变细胞生长发育的微环境。Cao 等[30]使用牛关节软骨细胞和PGA/PLA 材料构成的3D 耳廓，在无胸腺小鼠体内成功构建了人耳形态组织工程软骨，为组织工程耳廓的构建提供了新思路，各类复合材料也成为主要的支架研究对象，旨在克服单一材料的缺陷[31]。García-López[32]在壳聚糖-聚乙烯醇-表氯醇水凝胶支架上接种猪耳软骨细胞后也观察到了耳软骨类似组织形成。2018 年，Zhou 等[33]报道将患者自体残耳软骨细胞接种在3D 打印的PCL/PGA/PLA 耳形支架上，在人体内实现了组织工程耳廓软骨组织的再生，象征着组织工程耳廓由动物实验向临床转化的重大进展。Lee 等[34]将兔耳软骨细胞分别接种在PLGA 支架、PLGA-Medpor 支架，结果发现后者可以产生更多成熟的软骨组织，并具有更强的抗压、抗皮肤张力能力。Medpor 的存在提供了良好的软骨微环境并提高了支架的机械性能，而可生物降解的PLGA 和工程组织软骨的包裹，又克服了Medpor 材质过硬导致的暴露、感染问题。

软骨脱细胞基质是一种理想的软骨特异性仿生和低炎症反应天然生物材料。Jia 等[35]制备了牛肩胛软骨脱细胞基质与明胶交联剂1∶1、总成分浓度为2%的混合悬液，引入PCL内芯，结合3D 打印、铸造成型和冷冻干燥技术，成功设计出了具有合适机械强度的三维立体耳廓，结合山羊耳软骨细胞后可在裸鼠体内再生成软骨样组织，并且保持良好弹性和精确人耳形结构。Bhattacharya 等[36]通过戊二醛交联结合γ 辐射的新型脱细胞方法获得了一种理想的无抗原活性的山羊脱细胞软骨基质，并首次用于小耳畸形患者的耳廓重建，为脱细胞基质在人耳状软骨再生中的应用和临床转化提供了重要的支持。

但是，软骨细胞在体外培养过程中随着传代数的递增，往往会出现快速去分化，这可能与参与维持软骨细胞表型的DNA 甲基化和miRNA 异常表达有关[37]。即便在目前已成功的临床病例中，使用的都是体外传代扩增至2～3 代的自体残耳软骨细胞，而构建正常耳廓软骨细胞数量需求巨大，虽然采用添加生长因子[38-40]、多层立体培养[41]、旋转动态培养[42]等方式，均被证实可有效地诱导软骨细胞增殖、保持扩增后细胞表型稳定，以及促进软骨组织形成，但是相应地增加了技术难度和操作的繁琐程度。

2.2 干细胞-支架构建体

干细胞具有广泛的分化潜能和更强的群体倍增能力。目前，软骨组织工程常用的种子细胞有骨髓间充质干细胞（Bone marrow stem cells，BMSCs）和脂肪间充质干细胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）。BMSCs 被认为比ADSCs 具有更高的软骨形成潜能，在含有相同或不含有生长因子的培养条件下，前者能产生更多的Ⅱ型胶原和蛋白聚糖[43]。但是，ADSCs 来源广泛，获取方便[44]。Tang 等[45]通过对比实验发现，BMSCs 联合脱细胞外基质支架无论是否添加外源性生长因子都可以生成含量丰富的软骨基质，形成软骨组织，克服了传统添加外源性生长因子、基因转染技术在诱导干细胞向成软骨细胞分化过程中可能出现的软骨骨化，甚至导致病原体污染等问题[46]。含有ADSCs 与离体小肠黏膜下层共培养物的耳状支架在裸鼠体内长期保持了其复杂结构及良好的生物力学性能，这为提高组织工程耳廓的形态和力学稳定提供了新的思路[47-48]。另外，Mahboudi 等[49]在聚左乳酸-聚乙烯醇纳米纤维支架上成功诱导人诱导多能干细胞向软骨细胞分化，提供了一种可能用于耳廓组织工程的新型组合。Kim 等[25]构建了负载扁桃体来源的间充质干细胞的3D 打印多孔聚氨酯支架和Medpor 支架，发现在体外随着培养时间延长，多孔聚氨酯材料比Medopr 具有更强的细胞增殖率，而在动物体内前者生成了更明显的胶原纤维和血管，支架的力学性能也与耳廓软骨相似，有望成为一种新的支架替代选择。

2.3 干细胞-软骨细胞-支架构建体

干细胞与软骨细胞共培养也是目前热门的研究方向，软骨细胞分泌系列生长因子可以模拟天然软骨微环境，诱导干细胞定向分化[50]，其分泌的甲状旁腺激素（PTH）也具有抑制干细胞成骨分化的能力[51]，干细胞的存在又减轻了软骨细胞数量需求的负担。1∶1 混合培养猪软骨细胞与猪ADSCs 高弹性冷冻凝胶（明胶/软骨素-6-硫酸盐/透明质酸/壳聚糖）三维支架[52]和1∶1 混合培养人耳软骨细胞与人BMSCs 的胶原水凝胶人耳状支架[29]，两者均观察到了与天然软骨相似的健康软骨组织形成。Sterodimas 等[53]首次在具有免疫活性的动物体内植入丝素蛋白/海藻酸盐—软骨间充质干细胞/兔耳软骨细胞3D 耳形支架，成功再生细胞外基质和软骨组织，且支架保持了基本的形态和柔韧性，证明这种共培养模式和支架组合在真实生物体内的可行性。

3 3D 生物打印技术

有别于传统的3D 打印，生物打印的材料同时含有液态生物材料、种子细胞以及必要的活性因子，又称之为生物墨水。其优势在于可以通过对生物墨水的精确分层放置，直接生成细胞和生物材料一体化的结构，达到既能控制功能成分空间位置，又具有特定形态的目的[54]，为具有复杂结构及组织的再生提供了新的方法。

3D 生物打印分为成像与设计、生物墨水的选择和打印三个步骤。目前常用的打印方式有喷墨、挤压和光辅助打印[55-56]。喷墨打印方法简单、灵活且成本低廉，可以打印单个细胞，所以分辨率高。缺点是只能打印液体材料，且由于生物墨水的沉积容易导致喷头堵塞，因此打印时细胞密度低，不利于组织构建。挤压法可以打印各种黏度的水凝胶材料和高密度细胞，且能维持比较精确和完整的形状结构。缺点是细胞分辨率低，而且打印过程中会对细胞造成较大的压力而导致部分细胞失活。光辅助打印又分为基于数字光处理打印（DLP）和激光辅助打印。DLP 打印的焦距为纳米级，所以分辨率高，而且是通过对平面投影进行打印，能保持较高的机械完整性，所以适用于打印光滑、结构复杂的模型。激光辅助打印的细胞分辨率和存活率都很高，但是打印成本较贵，而且打印的生物原材料仅限于光敏聚合物。

目前已知的可打印的生物墨水种类较少。Héctor 等[57]以人鼻软骨细胞-纳米纤维素-海藻酸钠为复合生物墨水，采用微阀头联合喷墨打印技术构建形成了三维立体耳廓，观察到软骨特异性细胞外基质成分的生成。Lee 等[58]以聚乙二醇为牺牲层，将负载软骨细胞的海藻酸钠水凝胶和PCL 采用喷头打印技术实现三维耳软骨组织的再生，通过添加可生物降解的PCL 材料改善了单纯水凝胶支架机械强度不稳定的缺点。Bhamare 等[59]通过挤压法对山羊耳廓软骨细胞与聚乙烯醇/明胶组成的生物墨水进行逐层打印堆积，实现了人耳形耳廓的快速自动打印，也成功再生细胞外基质、血管及软骨组织。Kang 等[60]描述了一种ITOP 集成打印装置，以Pluronic F-127水凝胶为牺牲层，将载有兔耳软骨细胞的复合水凝胶（明胶、纤维蛋白原、透明质酸和甘油）和PCL 按照特定模式打印成具有稳定机械强度的人耳状软骨结构，在裸鼠体内收获了与天然兔耳相似的软骨组织。这种集成模式的优势在于可以在精确的位置融合多种细胞类型，生成各种自由的三维结构，有望在临床中再生缺损的组织和器官，再现其自然结构和功能。

4 总结与展望

目前在动物体内外构建了许多稳定的、可供耳软骨细胞良好生长和分化的三维立体耳廓模式，但仍然存在许多难题需要攻克。首先，3D 生物打印对生物墨水的种类、组成成分要求较高，已知可供打印的生物墨水种类很少；其次，如何协调组织工程支架在体内降解与软骨组织再生速率之间的平衡，保证耳廓形态得到长久维持；再者，目前大量的研究局限于体外实验和无免疫原性的动物实验，正常生物体内的长期安全性和有效性尚未得到有效验证。另外，现在的研究集中于可植入的耳廓软骨组织，尚未涉及更复杂的组织，比如脂肪、覆盖的软骨膜和皮肤等。未来的研究或许可以利用3D 生物打印技术通过将软骨细胞、脂肪细胞、上皮细胞与液态生物材料混合，进行成分的区域分配，提高再造耳的组织复杂性，减少需要提前扩张皮瓣或者同期、延期行皮瓣筋膜移植覆盖的步骤，收获真正具有完整组织的组织工程耳，为耳畸形患者的耳廓重建开创新的方向。