颊脂垫干细胞在骨组织工程中的研究进展

杨晓华 何乐人

近年来应用骨组织工程修复骨缺损已取得一定的临床进展，目前骨髓间充质干细胞仍是骨组织工程最常用的干细胞来源，但存在以下缺点：获取时需对供体进行侵入性操作，不仅创伤大[1-2]，获得的干细胞少[3-4]，而且供体年龄会影响干细胞的成骨分化能力[5-6]。脂肪来源干细胞具有多向分化的潜能，且来源广泛，获取相对容易[3]，所以脂肪干细胞具有一定优势。

但吸脂术要求具有一定厚度的皮下脂肪，且术后常常存在血肿、硬结、感觉异常等并发症。颊脂垫是位于颊肌和咬肌之间的一团具有完整包膜的脂肪组织，位置固定，体积与年龄、性别、体重无明显相关性，个体差异小。因易于从口腔内获取，血供丰富，具有一定体积，已被广泛用于口腔和颌面整形修复手术中[7-8]。

研究发现颊脂垫中存在具有成骨分化能力的干细胞。本文对颊脂垫来源干细胞的研究应用进展进行综述，总结其成骨能力和诱导新生骨的潜在优势，为骨组织工程种子细胞来源提供参考。

1 颊脂垫干细胞和诱导成骨分化

20 世纪80 年代发现脂肪组织中存在干细胞以来，获取皮下脂肪干细胞的实验方法是经过胶原酶消化、过滤、离心除去成熟脂肪细胞后，得到基质血管组分（SVF），该组分是包含脂肪间充质干细胞（Adipose stromal/stem cell，ASC）、内皮细胞、红细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、单核/巨噬细胞、周细胞在内的异质性成分[9]。2006 年，Pyo 等[10]将该实验方法用于颊脂垫，获取的细胞滤液传代培养，取第3 代细胞，免疫荧光实验示该细胞群表面标志物CD34-、CD105+、STRO1+，继续培养并分别接种于普通培养基和成骨诱导培养基，发现成骨诱导培养基中的细胞在第14、21 天ALP 活性显著升高，茜素红浓染，第21 天RT-PCR 检测到OC 基因的表达。该实验证实颊脂垫中也存在干细胞，并且可以分化成骨。2010 年，Farre′-Guasch 等[11]运用相同的分离方法得到颊脂垫中的间充质干细胞（BFP-ASC），阳性对照采用皮下脂肪干细胞（SC-ASC），经诱导培养后两种脂肪细胞形态相似，都表达CD73、CD90、CD105，不表达CD45、CD19、CD14、HLADR，ALP 水平在第7天后开始上升，2 周后茜素红染色浓染，成骨相关基因表达增加。该实验证实在合适的诱导条件下，颊脂垫中的基质血管组分含有的干细胞能向骨组织细胞分化。

2 颊脂垫干细胞特性和成骨分化能力

Farré-Guasch 等[11]观察到，在培养的第2～4 天BFP-ASC保持静止状态，之后快速生长分裂至融合状态，呈单层大扁平细胞样，培养7 d 后，BPF-ASC 的形态变成成纤维细胞样的纺锤型，这是间充质干细胞的典型形态。Broccaioli 等[12]、Niada等[13]之后的研究也都观察到，不论是取自人还是猪的颊脂垫，大概在传代培养至第7 天，BFP-ASC 会变成纺锤型细胞。

通常对传代培养至第2～4 代的细胞进行流式细胞学分析，大部分体外试验[11-12，14]都发现人BFP-ASC 表达间充质干细胞表面标志物：CD105、CD73、CD29、CD90、CD44，极少量甚至不表达 造血系细胞表面标志[13]：CD45、CD19、CD14、HLADR、CD34、CD31、CD146 是血管内皮细胞谱系的代表性标志物，培养初期的BFP-ASC 能表达CD146、CD29，经过传代培养后CD146 消失。但Rezai 等[15]在第3 代BFP-ASC 中也观察到CD146、CD34 的高表达，考虑是因为颊脂垫是富血管的脂肪组织，且微血管的存在有利于新生骨的生长[11]。Fuji maki[16]发现第1 代BFP-ASC 中18.6%细胞表现为αSMA+（肌细胞），12.8%细胞表现为CD45+（淋巴细胞），13.3%细胞表现为CD11b+（单核细胞），进一步证实了从SVF 中分离的BFP-ASC 是一群异质性细胞。ASC 表面不表达免疫相关抗原[17]，如MHC-II、HLA-DR、CD40、CD40L、CD80、CD86，并且抑制自体细胞诱导的淋巴细胞增殖。

Farre′-Guasch 等[11]计数了每克脂肪组织的细胞产量，结果显示每克BFP 组织细胞产量与每克SC 组织细胞产量没有统计学差异；Broccaioli 等[12]从皮下组织和颊脂垫中也获取了近似的细胞产量，多个实验比较细胞倍增时间、MTT 实验结果、成纤维细胞集落形成单位计数（Fibroblast-colony-forming unit assay，CFU-F），结果显示SC-ASC 与BFP-ASC 结果相近，没有统计学差异，表明BFP-ASC 具备脂肪干细胞的生长分裂能力[12-13]。

Farré-Guasch 等[11]观察到培养1 周后，人BFP-ASC 在逐渐形成成纤维细胞的过程中，ALP 的活性逐渐升高直至第21天，第7 天的ALP 活性是初始细胞的2.5 倍，第14 天是16.5 倍。在诱导骨分化的第14 天，成骨基因CBFA1、骨连接素基因SPARC 的表达分别增长了8 倍、2 倍，免疫荧光显示BFP-ASC 在骨诱导培养后表达骨钙素（Osteocalcin，OCN），BFP-ASC 在骨诱导培养2 周后显微镜下见茜素红强染色，提示细胞外基质的钙沉积显著。对猪BFP-ASC 和SC-ASC 的研究表明，两组ASC 都在骨诱导分化后高表达胶原蛋白、钙化沉积的细胞外基质、骨连接素和高活性ALP[18]。

3 颊脂垫去分化脂肪干细胞（DFAT）与颊脂垫脂肪间充质干细胞

颊脂垫主要由成熟脂肪组织和基质血管组分（SVF）构成，在证实了SVF 中存在干细胞后，分离出成熟脂肪细胞，通过天花板培养法从中获取去分化脂肪细胞（Dedifferentiated fat cell，DFAT），显微镜下观察细胞形态，成熟脂肪细胞通过脱去脂滴形成纺锤型的DFAT，在合适的骨诱导培养基中传代培养能分化出骨组织。Kishimoto 等[19]从同一人体的颊脂垫中分化出ASC 和DFAT，并将两者进行比较研究。在培养的第3 天，BFP-ASC 的DNA 含量明显高于DFAT，但在第7、14天时两者没有显著差异，两者增殖能力相似，都表达CD90、CD105，不表达CD11b、CD34、CD45，但经过成骨诱导的DFAT 中DNA 含量、BAP、OCN、钙分布都显著高于ASC。成骨诱导第14 天，DFAT 的矿化结节和茜素红染色较ASC 明显，显示DFAT 的骨分化能力高于ASC。

对DFAT 的研究还包括成脂倾向和细胞直径。Kou 等[20]从人BFP 中分离出DFAT 后分别进行骨诱导和脂肪诱导分化，DFAT 细胞表面表达CD13、CD29、CD105、CD44，不表达CD31、CD34、CD309、CD106 和α-SMA，尽管将骨诱导分化的时间延长至3 周，DFAT 细胞外基质茜素红染色仍有限，且相当大比例的细胞呈多边形、油红O 浓染，提示DFAT 细胞的脂肪分化能力可能强于骨分化能力，这也许和DFAT 本身来源于脂肪组织有关。Tsurumachi 等[18]以成熟脂肪细胞直径40 μm 为界，研究大、小脂肪细胞去分化为DFAT 细胞的差异，结果大DFAT、小DFAT 都高表达CD13、CD90、CD73、CD105、CD44，增殖能力没有差异，但S-DFAT 多向分化相关基因表达水平更高，ALP 活性、茜素红染色、钙分布更多。该研究还发现，小DFAT 在1 周的传代培养后逐渐在细胞表面表达CD146，且表达水平大于大DFAT，之前的研究中DFAT表面不表达CD146，认为这是因为DFAT 在传代培养的过程中逐渐获得周细胞的特征。

4 颊脂垫间充质干细胞与皮下脂肪干细胞的对比

体外试验表明，颊脂垫间充质干细胞的增殖能力、成骨分化能力与皮下脂肪干细胞相当。张圣敏等[21]分别提取面部轮廓整形手术中获取的人颊脂垫和吸脂术获取的皮下脂肪，分别进行体外传代培养与成骨诱导，发现两种干细胞形态差异不大，均表达CD44，不表达CD34，但颊脂垫细胞产量高于皮下脂肪，ALP 水平也显著高于皮下脂肪，表明颊脂垫含有的脂肪干细胞生物学活性优于吸脂术皮下脂肪。Broccaioli等[12]的研究表明，上述两种脂肪干细胞都表达CD73、CD90、CD105，不表达CD34、CD31、CD14，细胞形态、增殖速度、细胞产量无显著差异，ALP 活性和胶原分布都显著上调。该研究显示，SC-ASC 表现为高度特异性的成纤维细胞样形态，细胞之间形态同质性高，BFP-ASC 相较之下同质性低，且细胞更小更圆。Niada 等[13]从猪身上获取颊脂垫和皮下脂肪，两种干细胞的细胞产量、形态、倍增时间、细胞活性相似，传代培养至第1～4 代都表现出良好的集落形成能力，都表达CD90，不表达CD271、CD14、CD45、CD73、CD105，胶原、钙化细胞外基质、ALP 活性、黏骨素表达都增加。考虑到颊脂垫组织采集量较少，认为颊脂垫脂肪干细胞的成骨能力优于一般皮下脂肪。Rezai 等[15]对比颊脂垫干细胞（BFPdSCs）、腹部脂肪干细胞（AbdSCs）、臀部脂肪干细胞（HdSCs）的干细胞特性，结果三种干细胞都高表达CD90、CD73、CD105、CD44，不表达CD34、CD45，BFPdSCs 中小部分细胞表达CD34、CD146，在低代细胞系，BFPdSCs 增殖速度更快、倍增时间更短。基于之前的研究，细胞传代培养代数会影响多向分化的能力，基因突变、细胞癌变、细胞凋亡和细菌污染的风险升高，因此认为干细胞疗法最好取用低代次的干细胞，安全性更好。成骨能力方面，在该实验中，在第7、14 天，BFP-ASC 的ALP、BMP2（早期成骨相关标志物）表达水平更高，第14 天时BFP-ASC 的RUNX2 表达水平明显更高。

5 颊脂垫间充质干细胞与其他干细胞的对比

Ghaderi 等[22]发现颊脂垫干细胞（BFP-MSCs）、牙槽干细胞（GDCs）都表达CD166、CD90、CD73、CD105、CD44，不表达CD34、CD45、CD14，但BFP-MSCs 钙化结节分布更多，成骨相关基因BGLA、BMP2 转录水平更高。相较于牙槽干细胞，颊脂垫干细胞是更优良的组织工程种子细胞。Genova 等[23]对比颊脂垫干细胞（BFPSCs）、牙髓干细胞（DPSCs），两种干细胞都能分化出骨样细胞、分泌钙化基质，但BFPSCs 细胞产量、增殖水平更高，虽然骨钙素释放也更高，但没有统计学差异。

6 诱导颊脂垫干细胞成骨分化的因素研究

骨形态发生蛋白（BMP）是能诱发异位性骨生成的转化生长因子之一，是常见的骨诱导培养基添加剂。Kim 等[24]研究BMP 浓度（0、10、50、100、200 ng/mL）对成骨分化的影响，结果显示50 ng/mL 以上的培养基中能在第14 天观察到ALP 染色、茜素红染色，第21 天染色加深，其中100 ng/mL 染色最深，第21 天各组均表达骨钙素，骨钙素的表达与BMP2 浓度相关，BMP2 超过100 ng/mL 骨钙素表达下降。研究指出，诱导颊脂垫干细胞成骨分化的BMP2 浓度至少应大于50 ng/mL。Shiraishi 等[14]将添加了BMP 的培养基与骨诱导培养基（Osteoinductive reagents，OSR）对比，BMP 组ALP 水平显著高于其他组，BMP 组、BMP+OS 组茜素红染色显著，成骨基因runx2、ocn、opn 表达显著上调，BMP 能诱导颊脂垫干细胞成骨分化。

Nagasaki 等[25]发现，低强度脉冲超声（LIPUS）联合纳米羟基磷灰石（NHA）处理的颊脂垫干细胞ALP 活性更高，茜素红浓染，成骨相关基因表达更多，证明LIPUS 处理和NHA 支架能协同促进颊脂垫干细胞成骨分化。

Shekarchi 等[26]研究雷奈酸锶对颊脂垫干细胞的成牙质骨诱导作用，浓度梯度为0、6、12.5、25、50、100 和200 μmol/L，结果100 μmol/L 组钙化水平最高，50、100 μmol/L 组颊脂垫干细胞成牙骨质蛋白表达水平最高，100 μmol/L 组ALP 水平最高，200 μmol/L 组OCN 水平最高。研究认为雷奈酸锶可上调BFPSCs 成牙骨质基因，诱导成牙骨质分化，并有剂量依赖性，可用于改善正畸治疗后的牙根吸收。

7 支架作用

Broccaioli 等[12]的研究显示，BFP-ASC 与釉原蛋白（Amelogenin，AM）混合培养1 周后接种在胶原蛋白膜和聚羟基乙酸上，都表现出高ALP 活性和广泛的胶原蛋白分布，这两种生物材料都具有良好的生物相容性，扫描电子显微镜观察也表明BFP-ASC 能较好地黏附于胶原蛋白膜和聚羟基乙酸上。Ardeshirylajimi 等[27]构造了被覆Bio-oss 骨粉的聚乳酸纳米支架，接种BFP-ASC 后，细胞黏附良好，与对照组相比，高表达干细胞标志物（CD40、CD90、CD105），ALP 活性高，茜素红浓染，钙沉积增多，证实了该支架良好地模拟了骨组织的细胞外环境，起到良好的支撑细胞和促进生长的作用。Shiraishi 等[14]在体外证实了重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）对BFP-ASC 的骨形成诱导作用后。Bastami 等[28]通过构建混合壳聚糖纳米颗粒的磷酸三钙（TCP）/明胶支架，证实了该支架具有缓慢释放BMP2 的作用，并加强了对BFP-ASC 的骨诱导作用。Golchin 等[29]将姜黄素混入壳聚糖/聚羟基乙酸纳米支架中，体外试验证实支架具有良好的生物支撑性能，接种于上的BFP-ASC 成骨分化良好。羟基磷灰石能促进BFP-ASC 成骨[25]，有研究将生物陶瓷纳米羟基磷灰石涂抹于聚己内酯（PCL）支架上，构建PCL-Bio 支架[30]，种植的BMSC、BFP-ASC 都能良好生长和进行成骨分化。但Rezai 等[31]的实验中，在被覆胶原蛋白的羟基磷灰石/β-TCP3D 打印支架上比较诱导多能干细胞和BFP-ASC 的成骨潜能，发现该支架对ASC 没有诱导成骨作用。研究显示，明胶-羟基磷灰石/氧化石墨烯支架能持续释放维生素D[32]，有利于BFP-ASC 的生长和分化。目前，大部分的支架实验都证实了对颊脂垫间充质干细胞的诱导成骨和支持作用，联合应用支架和干细胞诱导体内成骨是修复骨缺损的趋势，但还需要更多的体内试验数据支持。

8 临床试验

已有研究将颊脂垫脂肪间充质干细胞应用于临床试验，从目前的报道来看，BFP-ASC 能在人颌面骨中良好地诱导产生新生骨组织。Khojasteh 等[33]在8 个巨大颌骨萎缩的患者中进行控制对照试验，观察BFP-ASC 对牙槽嵴的修复效果。对照组将前髂嵴骨移植入牙槽骨缺损部位，填充冻干骨颗粒生物支架并覆盖胶原蛋白膜，实验组的冻干骨颗粒在填充前种植BFP-ASC，术后5 个月时进行临床效果评估。活检显示，新生骨融入并生成了类骨基质，新生骨比例在对照组中为49.21%，试验组为65.32%。自体髂骨移植同时满足了骨髓干细胞和机械支撑的移植条件，但术后骨质吸收率高，1 年后的骨质吸收率在35%～51%。Khojasteh 等[33]认为添加BFP-ASC能辅助骨组织再生，联合自体髂骨移植能减少术区骨质吸收。Khojasteh 等[34]进行前瞻性随机临床试验，发现髂前嵴联合BFP-ASC 能促进牙槽突裂骨缺损区新生骨重建，侧支皮质骨板对支架上的干细胞有机械保护作用。Khojasteh 等[35]从14 例下颌骨萎缩患者中采集BFP-ASC，分别将BFP-ASC 和自体骨颗粒与牛骨矿物支架以1∶1 的比例混合，术区覆盖钛网支撑固定，术后6 个月利用锥形线束计算机体层成像（Cone beam computed tomography，CBCT）评估下颌骨体积增量，结果显示两组水平方向和垂直方向的骨体积增加没有显著差异，颊脂垫也许能取代自体骨颗粒作为移植供点，减少手术创伤和术后并发症。Meshram 等[36]从5 例颌骨缺损患者中采集颊脂垫组织，体外扩增培养得到的BFP-ASC 直接逐滴加入骨缺损区，影像学评估显示术后1 个月所有患者术区出现不规则的骨小梁，接下来的3～6 个月逐渐被致密骨取代，证实BFP-ASC 对颌骨2 cm×4 cm 左右缺损的临床修复能力。Meshram 认为，考虑到BFP-ASC 的成骨能力和效率，避免联合生物支架应用于骨组织工程，能减少宿主对合成高分子材料的免疫排斥反应。Khojasteh 等[33]将BFP-ASC 接种于天然牛骨矿物材料上，移植人体后6 个月后修复了2 例巨大牙槽骨缺损，随后进行牙种植术，术后10 个月种植体生长良好。Akhlaghi 等[37]则将BFP-ASC 接种于人羊膜上，修复了5 例下颌骨缺损。

9 结论

大量的研究证明，颊脂垫含有多向分化潜能的间充质干细胞，获取方便、创伤小，干细胞产量大，成骨诱导分化能力明确，颊脂垫干细胞表达血管形成标志物，微血管的存在更有利于新生骨长入，是良好的干细胞组织供材。颊脂垫干细胞与皮下脂肪干细胞相比，两者的成骨分化能力相当，对于皮下脂肪菲薄、不宜进行吸脂术的患者是另一种可供参考的选择。但要将颊脂垫干细胞应用于临床仍需进一步评估颊脂垫的实用性。目前颊脂垫干细胞的临床研究集中于骨组织工程，基础实验也研究了颊脂垫干细胞的软骨分化能力，为组织工程软骨移植提供了新思路。