脂肪干细胞分泌的细胞外囊泡提高脂肪移植存活率的研究进展

刘轩辰 李洁 马继光

脂肪组织是理想的软组织填充材料，目前广泛应用于美容填充、组织重建和瘢痕治疗等领域[1-5]，提高移植脂肪的存活率是相关研究的热点问题。已有研究表明，向脂肪移植物中添加基质血管成分[6]、脂肪干细胞（Adipose-derived stem cell,ADSCs）[7]、ADSCs 分泌的细胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs）[8]、富血小板血浆[9]、细胞因子[10]等，都可提高移植脂肪的存活率。其中，EVs 是近年来的研究热点。本文拟从细胞外囊泡的定义、分离方法、移植方法及其在提高脂肪移植存活率中的作用等方面进行综述，总结细胞外囊泡提高脂肪移植存活率的作用机制和现有研究的不足之处，并展望后续研究的方向。

1 定义及特点

EVs 是由细胞释放到细胞外微环境的膜状囊泡。血液、尿液、脑脊液、唾液、羊水、母乳等体液中均含有EVs。尽管EVs 目前指代所有的分泌囊泡，但其内容物、大小以及膜组成实际上是高度异质及动态变化的[11]。EVs 主要分为三类：外泌体、微囊泡及凋亡小体，这三种EVs 产生的机制有所不同。外泌体的形成始于细胞内陷形成多囊泡体，多囊泡体与胞膜融合后以出芽的方式分泌到细胞外。微囊泡是细胞膜以直接向外出芽的方式向内环境中分泌囊泡。凋亡小体是在细胞凋亡过程中产生的[11]。在功能上，EVs 具有运输蛋白质、核酸和脂质的能力，EVs 介导的信号转导可以通过以上几种生物分子进行传递，参与跨细胞的信息交流，从而影响分泌细胞以及受体细胞的各种生理、病理活动[12]。

在电子显微镜下，ADSCs 分泌的EVs 大多呈杯形或球形，为脂质双分子层结构，直径为50～1 000 nm，平均电位在-16.68 mV 左右,高表达CD9、CD63、CD81、TSG101，低表达3-磷酸甘油醛脱氢酶、钙联蛋白[8,13-16]。其中,外泌体为两面凹陷的圆盘形或杯形，直径大多在20～400 nm，大多数粒径小于200 nm，表面标志物包括CD9、CD63、CD81、TSG101、β-actin 等[17-21]。

2 分离及辅助移植方法

吸脂手术获得的脂肪组织中含有丰富的EVs[8]。EVs 的分离是关键步骤，分离方法包括差速离心法、密度梯度离心法、免疫吸附法、沉淀法、超滤法和凝胶渗透色谱法等[22]。其中，最常使用的是差速离心法，即将脂肪抽吸液中的液体成分采取逐渐提高离心速度的方法进行分离。起始的离心速度较低，将较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集上清液，改用较高的离心速度离心上清液，将较小的EVs 颗粒沉降，以达到分离EVs 的目的[8]。EVs 辅助脂肪移植的操作方法主要有两种：一种是将脂肪颗粒注射到皮下，再将外泌体注射入静脉中[20]；另一种是将脂肪颗粒与EVs 混合后再进行移植[8,13,16]。

3 EVs 提高脂肪移植存活率

EVs 与脂肪混合移植后移植物体积、湿重均显著高于单纯脂肪移植组[13,16,19]。然而，有研究表明，术后2 周富含EVs的移植物体积留存率与单纯脂肪移植组之间没有统计学差异；在第4 周、8 周时两组体积留存率才有统计学差异，提示EVs 的作用具有一定的时间依赖性[23]。除了提高脂肪移植存活率，EVs 还有助于维持脂肪结构完整性。对添加外泌体的移植物和单纯脂肪移植物切片进行脂滴包被蛋白（活体人类脂肪细胞的标志物）染色，添加外泌体的移植物切片中脂滴包被蛋白阳性的脂肪细胞数量多于单纯脂肪移植组[13,17]。

4 EVs 提高脂肪移植存活率的机制

4.1 促进血管生成

4.1.1 促进内皮细胞增殖、迁移及管状形成

由于移植物的血运局限于移植组织的外周区域，而中央区域缺少营养和氧气，导致脂肪细胞与干细胞凋亡，从而使得移植后脂肪体积逐渐减小。因此，提高移植物受区血运有助于提高脂肪移植存活率[20]。激光多普勒血流检测仪检测到添加外泌体的移植物周围微循环血液灌注增加，而不含外泌体的移植物表面血管化相对较差[17]。

EVs 可促进血管生成。血管内皮细胞的增殖和迁移是血管生成的基础。造血干细胞/祖细胞和内皮细胞均表达CD34[24]，使用CD34 抗体对组织切片进行免疫组化染色可发现添加EVs 的移植物CD34 表达明显增加，表明移植物中毛细血管数量增加[16]。CD31 是内皮细胞及其祖细胞的经典标志物[24]，对脂肪移植物切片进行CD31 免疫荧光染色，发现添加EVs 的移植物中CD31 表达增加，表明毛细血管密度升高[14-15,17-20]。此外，EVs 辅助移植组Ki67+细胞含量增加，提示内皮细胞增殖能力增强[13,16]。通过细胞划痕实验评估EVs 对人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,hUVECs）迁移速度的影响，在培养基中添加EVs 后观察到hUVECs 的迁移速度在第12、24 小时显著增加，表明EVs 可加速HUVECs 迁移[8,17]。

ADSCs 分泌的EVs 可促进hUVECs 管状结构形成，表现为hUVECs 与EVs 共同培养后，hUVECs 管状结构的长度及数量显著增加[8,13]。在培养基中添加外泌体12 h 后，hUVECs的管状结构数量达到峰值，表明外泌体的影响可能具有一定时间依赖性，外泌体转运的促进血管生成的蛋白与脂肪细胞接触后发挥作用，12 h 后可能会被灭活[18]。Nie 等[23]比较了浓度为0、25、50、100 μg/mL 的富含EVs 的脱细胞脂肪组织凝胶，发现50 μg/mL 的EVs 促进管状形成的能力最强，继续增大EVs 剂量并不能进一步增强EVs 促进血管内皮细胞生成的能力，提示EVs 的作用具有一定的浓度依赖性。

4.1.2 提高促血管生成因子表达

EVs 可通过促进血管生成相关基因的表达及蛋白质的分泌而发挥作用。qRT-PCR 检测发现，外泌体可以上调血管生成素-1 和酪氨酸蛋白激酶受体-1 的mRNA 的表达[18]。EVs通过上调let-7 家族的表达，抑制argonaute1 的mRNA 表达，最终增加了血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）的mRNA 表达[15]。EVs 中所含的蛋白质、肽类也可促进血管生成。外泌体辅助移植可提高移植物中30 多种生长因子的表达，包括VEGF、肝细胞生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血管生成素、酪氨酸蛋白激酶受体-2、单核细胞趋化蛋白、过氧化物酶体增殖物活化受体γ、转录因子CCAAT/增强子结合蛋白-β 等[18]。VEGF 是内皮细胞特有的血管生成因子[25]，VEGF/VEGF-R 信号在调控新生血管形成中起关键作用，如诱导基因表达、调节血管通透性、促进细胞迁移、增殖和存活[26]。研究发现，添加外泌体的移植脂肪中VEGF-R 表达均高于单纯脂肪移植组，表明VEGF/VEGF-R 参与了外泌体介导的体内血管生成[16,18]。

4.2 调节炎症反应

除了促进移植物早期血运重建外，EVs 还可以减轻脂肪移植物中的炎症反应。组织学分析发现，EVs 辅助脂肪移植组的脂肪形态更完整、细胞分布更均匀；而单纯脂肪移植组中脂肪组织出现更多的坏死、纤维化及炎症浸润[13]。单纯脂肪移植15 d 后可见炎性细胞浸润和组织坏死；然而在添加外泌体的移植物中直到30 d 后才出现这些病理变化，并且坏死的程度较轻[18]。

EVs 可通过促进巨噬细胞的极化上调M2 型巨噬细胞的表达，继而促进脂肪移植物血管生成并提高脂肪移植存活率。巨噬细胞分为M1 和M2 两种类型，巨噬细胞的极化状态可影响其促炎和抗炎反应：M1 型巨噬细胞是具有病原体杀伤能力的促炎表型，M2 型巨噬细胞是具有促进细胞增殖和组织修复的抗炎表型[27]。被摄取到巨噬细胞中的EVs 可诱导M2 型巨噬细胞的极化。将添加EVs 的移植物切片进行免疫组化染色，发现移植物外周及中心区域F4/80+、CD206+的M2型巨噬细胞密度增加；流式细胞分析也提示添加EVs 的移植物CD206+M2 型巨噬细胞比例增加，CD11c+M1 型巨噬细胞比例减少[14]。在转录层面，ADSCs 分泌的外泌体与巨噬细胞一同培养，发现M2 型巨噬细胞的mRNA 表达增加[20]。巨噬细胞极化的机制还未完全阐明，有研究提出ADSCs 分泌的外泌体通过分泌let-7c，下调转录因子CCAAT/增强子结合蛋白-δ 表达水平，导致M2 巨噬细胞分化增加，M1 型巨噬细胞分化减少[20]。分别将生理盐水和M2 型巨噬细胞与移植物混合后移植到小鼠头皮下，移植3 个月后发现添加M2 型巨噬细胞的移植物与添加生理盐水的移植物相比，血管密度增加了157%，且添加M2 型巨噬细胞的移植物体积约为添加生理盐水移植物的2.6 倍，表明M2 型巨噬细胞可促进移植物新生血管生成并提高自体脂肪移植存活率[28]。

5 总结与展望

EVs 中丰富的蛋白质及核酸组成可调节血管生成、内皮细胞增殖、内皮细胞迁移等，最终提高了移植脂肪的存活率[8]。EVs 作为一种新型纳米材料已被广泛应用于不同领域，但是在应用EVs 的过程中尚存在许多问题。首先，EVs 的来源有限，EVs 的产量成为研究的限速步骤。可通过3D 细胞培养技术扩增细胞，或者是改良提取技术，在提取EVs 的过程中尽可能减少损失[16,21]。其次，从脂肪抽吸液中提取的EVs 是混合物，分析EVs 的具体成分有助于进一步了解EVs 对脂肪存活率的影响[8]。再次，由于EVs 在组织中寿命很短，限制了其在实际临床工作中的应用，与单次使用总量相同的EVs 相比，多次定时添加EVs 可以更好地提高脂肪移植存活率[8,29]。此外，获取外泌体的过程十分复杂，目前已有去除白细胞的纯化外泌体产品，可避免同种异体的免疫排斥反应；并且该产品可在室温下存放一年，便于运输和保存[30]。目前EVs 辅助脂肪移植的体内研究仅限于动物实验，待临床应用推广还有很长的距离。随着EVs 辅助脂肪移植研究的不断进展，EVs有望成为提高脂肪移植存活率的理想方法。