间充质干细胞外泌体对腹膜间皮细胞高糖损伤的作用研究

纪鸥洋 方均燕 宋阿会 佟琰 魏珊 陈志豪 刘英莉

腹膜透析（Peritoneal dialysis，PD）是终末期肾病（End－stage renal disease，ESRD）的主要治疗方法之一[1]。腹膜炎是腹膜透析患者住院治疗、腹透失败、转换成血液透析的最常见原因之一。患者长期反复发生腹膜炎会导致腹膜结构和功能改变，严重影响腹膜超滤、透析效能[2]。腹膜透析相关性腹膜炎的发生与腹膜超滤失败的具体分子机制仍不清楚，近年来有多项研究提示腹膜细胞炎症损伤、新生血管及腹膜纤维化形成是该过程的几个重要特征性改变[3]。在长时间高渗高糖腹膜透析液的作用下，葡萄糖降解产物会刺激腹膜间皮细胞产生活性氧类（ROS）、分泌炎症因子，使细胞长期处于微炎症状态，进而导致新生血管形成和腹膜组织的纤维化[4－5]。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）是人体最重要的成体干细胞之一，来源广泛、增殖快，并具有低免疫原性和多项分化潜能。研究证实，MSCs 的作用是通过旁分泌途径来实现的，并且其与免疫调节、趋化、抗凋亡和血管生成等机制密切相关[6－7]。MSCs 相比于其他细胞能产生大量的外泌体，相关研究有望成为再生医学的重要发展方向[8]。我们的前期研究发现，干扰MSCs 的离子通道表达会对其产生的外泌体的抗炎作用造成影响[9]，而MSCs 来源的外泌体对腹膜透析中腹膜间皮细胞的抗炎保护作用尚未见报道。本研究拟通过观察高糖诱导下MSCs 外泌体对腹膜间皮细胞的作用机制，为探索MSCs 外泌体修复腹膜间皮损伤的分子机制奠定基础，为腹膜透析并发腹膜炎的临床防治提供更为广阔的思路。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

人膜间皮细胞（Human membrane mesothelial cells，MET－5A）由上海交通大学医学院附属仁济医院肾内科实验室提供。人间充质干细胞（Human mesenchymal stem cells,hMSCs）取自上海市第一妇婴保健院产科健康足月新生儿的脐带样本，产妇及家属均知情同意。

M199 培养基（Hyclone，美国）；葡萄糖粉（Sigma，美国）；胎牛血清（Gibco，美国）；胰蛋白酶（Gibco，美国）；青链霉素双抗（新赛美生物科技有限公司）；ExoQuick 试剂盒（SBI，美国）；CCK8 试剂盒（Dojindo，日本）；细胞凋亡检测试剂盒（BD，美国）；TRIzol 试剂（Sigma，美国）；PCR 引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]；逆转录试剂盒，SYBR Green Real－time PCR 试剂盒（TaKaRa，日本）；人IL－6 ELISA 试剂盒（Bioligend，美国）。

本研究经上海交通大学医学院附属第九人民医院伦理委员会审核批准。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养

取出并复苏MET－5A 细胞，用含10%胎牛血清和1%双抗的M199 培养基重悬细胞并接种于培养皿中，待细胞达到80%融合时进行后续实验。

1.2.2 间充质干细胞外泌体（MSCs－Exo）的提取和鉴定

在前期工作中，我们已经成功分离、培养了人脐带间充质干细胞，流式细胞仪检测显示其高表达CD90 和CD73、低表达CD45，符合MSC 表型[9]。根据ExoQuick 试剂盒说明书，继续从培养MSCs 的上清液中提取、分离外泌体，并储存于－80 ℃备用。使用透射电镜（TEM）、纳米粒子跟踪分析技术（NTA）和Western Blot 分别检测外泌体的形态、粒径分布和表面标志物。

1.2.3 CCK－8 法检测细胞的增殖

使用CCK－8 试剂盒检测Met－5A 细胞的增殖活力，并选出高糖和间充质干细胞外泌体的最佳刺激浓度。将Met－5A 细胞按5×103个/孔的密度接种于96 孔板，贴壁后待细胞达到80%融合时，分别使用1.5%、2.5%和4.25%葡萄糖处理MET－5A 细胞24 h，并设正常对照（不加任何干预），每组7 个复孔。选取刺激效果最显著的高糖浓度（4.25%高糖）细胞分别予10 μg/mL、100 μg/mL MSCs－Exo 共同培养MET－5A 细胞24 h。根据CCK－8 的实验结果，选用4.25%高糖和100 μg/mL MSCs－Exo 作为后续实验的条件。

1.2.4 流式细胞技术检测细胞的凋亡

将Met－5A 细胞接种于6 孔板，待贴壁细胞达80%融合时将细胞随机分为以下3 组：①正常对照组（C 组），不做任何干预处理；②高糖组，加4.25%葡萄糖作用24 h；③共培养组：加4.25%葡萄糖和100 μg/mL MSCs－Exo 共同作用24 h。收集各孔培养上清和细胞悬液离心后弃去上清液，加入100 μL结合液重悬细胞，依次加入5 μL Annexin Ⅴ－FITC和5 μL PI，避光孵育15 min 后于流式细胞仪上检测细胞凋亡情况。

1.2.5 qRT－PCR 检测IL－6、TNF－α 表达

用TRIzol 试剂从3 组细胞中分别提取其总RNA，然后用逆转录试剂盒制成cDNA。使用GAPDH 为内参，利用SYBR Green Real-time PCR试剂盒测定IL-6、TNF-α 的mRNA 的表达水平。PCR 过程包括95 ℃变性30 s、95 ℃5 s、60 ℃退火34 s，循环40 次。引物序列如下：GAPDH，5'-3'ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG，3' -5'GCCATCACG CCACAGTTTC；IL -6，5' -3'CCTGAACCTTCCAAA GATGGC，3'-5'TTCACCAGGCAAGTCTCCTCA；TNFα，5' -3'TCACATGCGCCTTGATGTCTG，3' -5'CGG GCCGATTGATCTCAGC。

1.2.6 ELISA 检测细胞培养上清液中IL-6 的水平

根据试剂盒说明书配制溶液并放置一定量的孔槽。每孔洗涤4 次后甩净拍干，加入50 μL 缓冲液、50 μL 的标准品以及待测样本，封板孵育2 h 后洗板4 次。加100 μL 的IL-6 检测抗体，封板孵育1 h洗板4 次；每孔内加入100 μL 亲和素标记的辣根过氧化物溶液，封板孵育30 min；弃去孔内液体洗板后加入100 μL 底物溶液，避光孵育15 min 后加入100 μL 终止液，混匀后迅速用酶标仪检测各孔在450 nm 和570 nm 处的吸光度值。

1.3 统计学方法

实验数据用GraphPad Prism Software 软件统计并作图，One-way ANOVA 法以及t 检验分析组间差异性。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外泌体分离鉴定结果

透射电镜观察显示，外泌体类似杯口状，质膜边缘清晰。纳米颗粒示踪分析技术显示，外泌体粒径为50～200 nm。Western blot 结果表明，提取的外泌体表达特异性表面标志物CD63 和CD81。

2.2 高糖和MSCs-Exo 对Met-5A 细胞增殖的影响

CCK-8 结果显示，与对照组相比，高糖组细胞增殖水平明显降低（P＜0.001），且随着浓度增加，其抑制效果越明显，高糖浓度为4.25%时抑制增殖效果最明显（图1）；不同浓度的MSCs-Exo 在与4.25%高糖共同刺激MET-5A 细胞24 h 后，与4.25%高糖组相比，共培养组Met-5A 细胞增殖水平明显增加，且与外泌体的浓度有相关性，其中100 μg/mL MSCs-Exo 共培养组细胞增殖活力提高最明显（图2），表明MSCs-Exo 可改善高糖对Met-5A 细胞增殖的抑制作用。

图1 CCK-8 检测不同浓度高糖对Met-5A 细胞增殖活力的影响Fig.1 The effects of different concentrations of high glucose on the cell viability of MET-5A cells by CCK-8

图2 CCK-8 检测高糖与不同浓度MSCs-Exo 共培养对Met-5A细胞增殖活力的影响Fig.2 The effects of different concentrations of MSCs-Exo cocultured with high glucose on the cell viability of MET-5A cells by CCK-8

2.3 高糖和MSCs-Exo 对Met-5A 细胞凋亡的影响

流式细胞检测结果显示（图3），与正常对照组对比，高糖组细胞凋亡明显增加（P＜0.001）；而与高糖组相比，共培养组细胞凋亡率明显降低。说明MSCs-Exo 可以缓解高糖对腹膜间皮细胞的促凋亡作用。

图3 高糖和MSCs-Exo 对Met-5A 细胞凋亡的影响Fig.3 Effects of high glucose and MSCs-Exo on apoptosis of MET-5A cells

2.4 高糖和MSCs-Exo 对Met-5A 细胞IL-6、TNFα 表达的影响

qRT-PCR 结果显示（图4），与正常对照组相比，高糖组细胞IL-6、TNF-α mRNA 的相对表达水平明显增高（P＜0.01）；与高糖组相比，共培养组Met-5A细胞IL-6、TNF-α 的表达降低（P＜0.05、P＜0.001）。

图4 高糖和MSCs-Exo 对Met-5A 细胞IL-6、TNF-α 表达的影响Fig.4 Effects of high glucose and MSCs-Exo on the expression of IL-6 and TNF-α in MET-5A cells

2.5 高糖和MSCs-Exo 对细胞培养上清液中炎症介质IL-6 表达的影响

为了进一步验证高糖和MSCs-Exo 对细胞IL-6的作用，我们通过Elisa 实验检测了上述三组细胞培养上清液中IL-6 的水平。结果显示，与正常对照组相比，高糖组细胞的IL-6 水平明显升高（P＜0.001）；与高糖组相比，共培养组Met-5A 细胞IL-6 的表达降低（P＜0.05）。说明MSCs-Exo 可以降低因高糖诱导的IL-6 的表达升高（图5）。

图5 高糖和MSCs-Exo 对细胞培养上清液中炎症介质IL-6 表达的影响Fig.5 Effects of high glucose and MSCs-Exo on the expression of IL-6 in cell culture supernatant

3 讨论

腹膜透析是终末期肾病患者重要的替代治疗方式之一，与血液透析相比，腹膜透析具有血流动力学较稳定，中分子毒素清除效率好，并可在一定程度上延缓残存肾功能下降等优点[10]。腹膜透析的有效性主要取决于腹膜结构和功能的完整性，目前认为高糖高渗性腹膜透析液的持续刺激是引起腹膜相关组织功能改变的重要原因之一[11]。既往的研究已经验证通过向腹腔内连续注射高糖腹透液可以构建腹透相关性腹膜损伤模型[12]。研究认为，高糖引起腹膜损伤可能是多种机制共同作用的结果，包括长链非编码RNA 差异性表达，激活下游MALAT1 分子表达增高使腹膜纤维化加重[13]；诱导间皮细胞产生活性氧，分泌TGF-β1、VEGF 等细胞因子和炎症因子，使细胞长期处于炎症状态，通过激活JNK/SAPK 等信号通路最终造成细胞凋亡和腹膜纤维化[4，14]；高糖诱导间皮细胞发生炎症自噬以及通过上调多种microRNA 的表达促进EMT 的发生[15-16]。本研究显示，不同浓度的高糖刺激可造成Met-5A 细胞增殖下降，IL-6、TNF-a 上调和凋亡增加，证实了高糖对腹膜间皮细胞存在促炎和促凋亡作用。但是，其具体的分子机制和作用靶点还需进一步的研究。

MSCs 具有独特的免疫调节活性，可有效干预炎症的进程。研究认为，MSCs 可以修复损伤细胞，通过外泌体或者隧道式纳米管发挥旁分泌作用，在体内起到免疫调控作用，包括抑制T 淋巴细胞的增殖和活化，干预炎症小体的活化[17]，调节T 细胞和巨噬细胞的极化和凋亡，促进机体从促炎状态向抗炎状态转化，帮助机体清除病原体[18-19]。MSCs 在很多炎症的疾病动物模型中均取得了良好的效果，在腹膜纤维化的动物实验中也证实其可以改善巨噬细胞的极化、下调促炎症因子、上调抗炎症因子的表达而延缓腹膜纤维化进程并改善腹膜超滤功能[20-21]。但细胞治疗中干预剂量和操作过程难以标准化，潜在的致瘤性以及细胞因子释放综合症等问题，导致干细胞治疗的临床应用受限。

外泌体是多种细胞类型释放的膜外囊泡，由磷脂双层包围，直径约30～130 nm，含有大量的蛋白质、脂质、mRNA、非编码RNA 等，是细胞间通信的重要信使。MSCs-Exo 与MSCs 一样具有免疫调控活性，可以减少促炎症细胞因子TNFα、NF-κB、IL-1β的表达，升高抗炎症因子TGF-β、IL-10、PGE2 的水平，并减少Th17 细胞的数量，上调Treg T 细胞的数量[22-23]，影响炎症小体的活化，并进一步减少巨噬细胞和淋巴细胞在损伤组织中的浸润，促进巨噬细胞从M1 型向M2 型转化[19]从而发挥免疫负调控作用。MSCs-Exo 治疗的优点：比MSC 具有更低的免疫原性，不会触发机体固有免疫和适应性免疫反应；不具有致瘤性，而且可以突破血脑屏障进入损伤组织[24]。在脓毒血症的动物模型中，MSCs 来源的外泌体能够依靠传递miR-223 抑制STAT3 激活，降低IL-6 等炎症因子的水平，也可以通过miR-146a 激活M2 巨噬细胞，提升IL-10 的水平来减轻机体的炎症反应[25]。因此，对MSCs-Exo 的研究有望成为免疫治疗未来发展的方向。

本研究发现，MSCs-Exo 与MET-5A 细胞共培养可抑制高糖的促凋亡作用，明显降低高糖对MET-5A 细胞的损伤作用，抑制高糖导致的炎症因子表达升高，说明MSCs-Exo 对高糖损伤的人腹膜间皮细胞存在一定的修复作用，对腹膜间皮细胞的生长发挥着重要的调控作用，为临床上提高腹膜透析患者的生存率提供了一种新的治疗思路。

尽管我们在体外实验中证实了MSCs-Exo 可有效减轻高糖溶液诱导的腹膜间皮细胞损伤，但其发挥调控作用的真正分子机制和下游信号还尚不明确，并且与MSCs 作用的差异性还需要进一步的验证和研究。MSCs-Exo 作为一种无细胞治疗手段，为改善腹膜透析相关性腹膜炎提供了一种新的可能性。