泛醌对大鼠背部皮瓣缺血再灌注损伤的作用与影响

张晓艺 张浩

皮瓣移植是目前修复难愈性创面与器官重建的最有效办法[1]，其成功的关键在于保证术后皮瓣的血液通畅[2]，而皮瓣的缺血再灌注损伤是皮瓣移植失败的重要原因之一[3-4]。本实验通过建立大鼠皮瓣模型来探究皮瓣缺血再灌注损伤的有效治疗措施及相关药物的应用前景。

1 资料与方法

1.1 实验动物

选用佳木斯大学动物实验中心的成年雄性SD大鼠（SPF 级）120 只，体质量（350±50）g，（10±2）周龄，均予单笼饲养，室温25 ℃，湿度49%。本研究全程遵循动物实验伦理要求。

1.2 实验方法

120 只大鼠随机分为假手术组、实验组和对照组三组，每组各40 只，背部提前2 d 刮除毛发（8%硫化钠）。手术当天大鼠用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，使之俯卧于实验台上，常规术区消毒。设计9.0 cm×6.0 cm 的背部皮瓣，以背中线为中轴线，蒂部处下位，上起自两肩胛下角连线，下至髂后上棘水平线，沿标记切开，分离组织，掀起皮瓣，结扎6 条大鼠背部皮肤主要供血血管的其中5 条，即左右胸背动脉、左右肋间动脉及左侧髂腰动脉，仅保留一条右侧髂腰动脉为大鼠背部皮瓣唯一供血血管，建立以右侧髂腰动脉为单一血管蒂的穿支皮瓣，实验组及对照组用显微血管夹夹闭蒂部血管即右侧髂腰动脉根部6 h 以后松开，三组均于手术操作后原位缝合。以此方式得到以大鼠背部单一血管为血管蒂的动物皮瓣缺血再灌注损伤模型（图1 A-F）。

1.3 术后处理

模型建立成功后，所有大鼠连续3 日给予庆大霉素（1.5 mg/kg）预防感染。实验组每天用灌胃给药方式给予溶于食用油的泛醌（Blackmores 公司，澳大利亚）50 mg/kg；为保证单一变量，假手术组和对照组每天给予等量的橄榄油，灌胃体积均为5 mL/kg。实验期间动物饲养于佳木斯大学动物实验中心，符合无特定病原体标准，单笼饲养，室温25 ℃，湿度49%，每日自由进食饮水。术后1、3、5、7 d 每组处死10 只大鼠。

1.4 观察指标

测量皮瓣存活面积，计算皮瓣存活率：覆盖透明膜，在透明膜上画出创口轮廓。清洗干燥后，沿着轮廓剪去多余的膜，记录剩余膜的重量（确保为同一人同一支笔）。皮瓣存活率=皮瓣存活部分对应透明膜重量/整个皮瓣对应透明膜重量×100%。

于皮瓣中央取1.0 cm×1.0 cm 大小的皮瓣组织，平均分为两半，一半行固定、包埋、切片、HE 染色后于显微镜下观察所取皮瓣组织细胞的存活情况；另一半从分子水平检测所取皮瓣中超氧化物歧化酶（SOD）活力及丙二醛（MDA）含量（图1 G-H）。

图1 实验方法Fig.1 Experimental method

1.5 统计分析

采用SPSS25.0 软件进行数据处理与分析。连续性变量以表示，各指标在不同时间点的差异性分析采用重复测量方差分析，若时间和分组两因素的交互作用不具有统计学意义，则关注两因素的主效应，若交互作用存在统计学意义，则分析两因素的单独效应。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 皮瓣存活率（表1）

表1 各组皮瓣存活率（%）Table 1 Flap survival rates in each group (%)

统计学分析显示，在时间上，F=311.128，P=0.000；在分组上，F=1 311.321，P=0.000；交互F=77.260，P=0.000，分析单独效应。

在时间上，除假手术组第5 天和第7 天，实验组第3 天和第5 天、第5 天和第7 天皮瓣存活率比较无统计学差异（P＞0.05），其他各组各时间点比较均有统计学差异（P＜0.05）。在分组上，各时间点各组比较均有统计学差异（P＜0.05）。

2.2 HE 染色结果（图2）

图2 HE 染色观察各组大鼠皮瓣（40×）Fig.2 HE staining of rat flaps in each group (40×)

2.2.1 对照组

第1 天：皮肤组织结构重度异常，组织糜烂，大量肌纤维及胶原纤维坏死变性（黄色箭头所示）；钙化明显（黑色箭头所示）；炎性细胞数量多、分布广泛（红色箭头所示）；出血明显（绿色箭头所示）。第3 天：皮肤组织结构中度异常，大量肌纤维坏死、性状发生变化（黄色箭头所示）；可见病理性钙化（黑色箭头所示）；组织可见大量炎症细胞广泛分布（红色箭头所示）；胶原纤维的排列及分布情况发生改变甚至紊乱（绿色箭头所示）；少量脂肪细胞浸润（蓝色箭头所示）。第5 天：皮肤组织结构中度异常，部分肌纤维坏死，并可见钙化（红色箭头所示）；组织可见大量炎症细胞（黑色箭头所示）；脂肪细胞不明显（黄色箭头所示）。第7 天：组织结构中度异常，部分胶原纤维排列紊乱，坏死（黑色箭头所示）；大量新幼毛细血管、红细胞存在于各组织间隙内（红色箭头所示）；有脂肪细胞出现但数量较少（黄色箭头所示）。

2.2.2 实验组

第1 天：皮肤组织结构重度异常，大部分肌纤维坏死，钙化区域明显（红色箭头所示）；组织内可见炎症细胞广泛分布（黑色箭头所示）。第3 天：组织结构中度异常，少部分肌纤维及胶原纤维坏死（黄色箭头所示）；组织可见很少的炎症细胞分布于各组织之间（黑色箭头所示）；新生血管也出现了一些，但数量极少（红色箭头所示）。第5 天：组织结构中度异常，胶原纤维的情况较好，排列较为有规律，肌纤维坏死情况及组织钙化程度不是很严重（黄色箭头所示）；有新生血管出现（红色箭头所示）；炎症细胞明显分布稀疏（黑色箭头所示）。第7 天：组织结构轻度异常，炎症细胞几乎不可见但仍有零星散落（黑色箭头所示）；血管有增多现象及趋势，胶原纤维排列规律规整；可见脂肪细胞浸润（红色箭头所示）。

2.2.3 假手术组

第1 天：组织结构轻度异常，纤维排列不规整，组织间隙因为水肿而增大（黑色箭头所示）；有炎症细胞的存在（红色箭头所示）。第3 天：组织结构轻度异常，纤维排列些许不规整，有炎症细胞存在但数量极少（红色箭头所示）；有很多侧枝循环建立（黑色箭头所示）。第5 天：组织结构轻度异常，胶原纤维排列规范，有侧枝循环建立，且数量多、新生血管成熟（黑色箭头所示）；组织之间炎性细胞零散分布，数量极少（红色箭头所示）。第7 天：组织结构可以说几乎全部正常，胶原纤维排列规整，组织间无炎性细胞存在。

2.3 皮瓣组织SOD 检查结果（表2）

表2 各组皮瓣组织SOD 检测结果（U/mg）Table 2 SOD test results of flap tissues in each group (U/mg)

统计学分析显示，在时间上，F=1 853.869，P=0.000；在分组上，F=9 038.282，P=0.000；交互F=182.644，P=0.000。

皮瓣组织SOD 在时间上，各组两两比较均存在统计学差异（P＜0.05）。在分组上，各时间点各组两两比较均存在统计学差异（P＜0.05）。

2.4 皮瓣组织MDA 检测结果（表3）

表3 各组皮瓣组织MDA 检测结果（nmol/mg）Table 3 MDA test results of flap tissues in each group (nmol/mg)

统计学分析显示，在时间上，F=243.786，P=0.000；在 分 组 上，F=827.107，P=0.000；交 互F=55.507，P=0.000。

皮瓣组织MDA 在时间上，各组两两比较均存在统计学差异（P＜0.05）。在分组上，除第7 天假手术组和实验组皮瓣组织MDA 无统计学差异外（P＞0.05），其余均存在统计学差异（P＜0.05）。

3 讨论

本研究结果显示，假手术组的皮瓣存活率优于实验组，实验组优于对照组。这证明造模是成功的，缺血6 h 确实达到了缺血再灌注损伤的目的。从表1 来看，假手术组术后第5 天与第7 天皮瓣存活率无明显差异，说明未经缺血再灌注损伤的皮瓣在第5 天已达到愈合的最佳状态。实验组第3 天与第5天、第5 天与第7 天之间均无差异，说明在第3 天已基本控制住皮瓣的坏死情况，但其恢复情况在给药状态下也不如假手术组。对照组在不用泛醌的情况下皮瓣存活率一直在下降，最后仅剩一半左右。从皮瓣存活率来看，缺血再灌注损伤的发生是客观存在的，但在抗氧化剂泛醌的作用下，皮瓣存活率已无明显下降。我们还同时测得了组织中SOD 和MDA 相对应的数值。SOD 可以帮助清除氧自由基，其数值越高说明皮瓣存活情况越好，通过表2 可以发现，无论是时间线上的对比还是不同组别之间的对比，其差异都是有统计学意义的。MDA 是组织发生缺血再灌注损伤过程中的负面产物，数值越高说明皮瓣存活情况越不好，通过表3 可以发现，仅术后第7 天假手术组与实验组不存在统计学差异，这说明用药1周后，皮瓣的炎症及过氧化等反应已基本得到控制。为了从组织水平再次确认泛醌究竟是否改善了皮瓣组织的存活情况，我们对取到的皮瓣组织进行了HE 染色，发现对照组情况最差，虽然第7 天时已可见毛细血管生成但仍有组织坏死、胶原纤维排列紊乱的现象。实验组第3 天的情况与其相似，第5 天虽也有少量肌纤维坏死，但胶原纤维排列尚规整，炎症细胞的分布也明显分散。假手术组情况最好，仅在初期有纤维排列轻度异常、水肿间隙增大等组织结构的轻度异常，第7 天时存活组织已基本正常。研究表明，轴型皮瓣的真实成活范围其实是略大于蒂部血管供血范围的，因为皮瓣的四周会产生超灌注现象。据此可以解释我们得到的数据情况相比肉眼观察的结果要更好一些。同时，我们也可以推测，即使部分血管断流也可以使皮瓣成活范围超过存活血管支配区域。

关于缺血再灌注损伤的机制的研究很多，其中活性氧自由基的作用学说已在多项实验中得到证实[5]。如果只是氧自由基增多且其清除途径正常的话，尚不能对组织造成明显伤害，关键在于清除氧自由基的酶类也会出现合成障碍、被清除过多等问题[6]。首先，缺氧和缺血诱导线粒体无氧代谢进而发生功能障碍。ATP 减少时离子泵的功能受到影响，钙离子滞留细胞内就会使细胞发生肿胀、其内酶系统就会被抑制。其次，液体再次回到组织器官时各种酶会因线粒体及电解质的状态而促进氧化反应[7]。最后，ROS滞留，诱导细胞凋亡[8]。

泛醌又叫辅酶Q10（CoQ10），具有亲脂性，是细胞内信息传递过程和物质转移过程的重要组成部分[9]，具有防止脂质和蛋白质过氧化的作用[10]，主要通过维护遗传信息来维持细胞的生存，同时可以降低细胞死亡、凋亡的概率[11]。本研究中，实验组术后给予泛醌，使其皮瓣存活面积明显优于对照组，SOD和MDA 的检测结果也证实了泛醌的作用。

综上所述，本研究成功制备了大鼠缺损再灌注损伤模型，并证实泛醌可有效减轻大鼠背部超大皮瓣的缺血再灌注损伤情况。