bFGF对hBMSCs增殖及成软骨能力影响的实验研究

赵丹丹 陶然 刘豫 曹谊林 周广东

bFGF对hBMSCs增殖及成软骨能力影响的实验研究

赵丹丹 陶然 刘豫 曹谊林 周广东

目的探索碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）增殖和成软骨能力的影响，并确定适用于hBMSCs体外软骨构建的细胞代次。方法获取hBMSCs，分别用DMEM和DMEM+bFGF培养基进行培养。两组细胞均传代至第4代，比较两组各代次hBMSCs的形态变化、细胞得率；取第3代细胞，用pellet法体外成软骨诱导培养3周，观察两组pellet大体观并进行Ⅱ型胶原染色。在上述实验基础上，取hBMSCs用DMEM+bFGF培养基进行培养，1∶3传代培养至第8代，观察各代次细胞的形态变化；对各代次pellet体外成软骨诱导培养3周后，行大体观察并进行Ⅱ型胶原染色。结果DMEM+bFGF培养体系下的细胞形态、细胞得率及成软骨能力等方面均优于DMEM组。DMEM+bFGF培养体系下，按照1∶3传代的细胞传至第6代仍能维持较好的细胞形态；第1～4代细胞均表达软骨特异性细胞外基质Ⅱ型胶原，第5及后续代次的细胞成软骨能力较差。结论bFGF可明显促进hBMSCs增殖，并可更好地维持hBMSCs的成软骨能力，在该培养体系下的第1~4代细胞适用于体外软骨构建。

碱性成纤维细胞生长因子 人骨髓间充质干细胞 细胞代次 软骨再生

软骨缺损是常见的临床治疗难题，组织工程技术为软骨缺损修复提供了新的思路[1]，基于组织工程技术进行软骨缺损修复的可行性已在大量研究中得到证实，并有多个研究团队已开展临床试验[2-3]。种子细胞，作为组织工程三要素之一，是软骨组织工程临床转化需解决的首要问题。骨髓间充质干细胞（BMSCs）来源广泛、易于取材，具有极强的体外增殖和软骨分化潜能，被认为是软骨组织工程临床转化理想的种子细胞来源之一[4-6]。在体外培养过程中维持其增殖和软骨分化潜能，是BMSCs用于组织工程软骨构建的关键。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），具有较强的促细胞增殖和软骨再生能力[7-9]，是目前细胞培养最具代表性的生长因子之一。然而，目前bFGF研究主要以动物细胞为研究对象，bFGF对hBMSCs增殖和成软骨能力的影响尚未确认。本研究以hBMSCs为研究对象，确定bFGF对其增殖和成软骨能力的影响，并进一步确定其适用于体外软骨构建的细胞代次，为hBMSCs用于软骨组织工程临床转化提供依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料、试剂及仪器

骨髓取自上海第六人民医院行髋关节置换手术的患者，共6例，每例 5 mL。患者平均年龄（50±5）岁。所有患者对实验知情同意，并签署知情同意书。

低糖DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素、两性霉素 B、磷酸盐缓冲液（Hyclone，美国）；bFGF（B&D，美国）；0.25%胰酶（Gibco，美国）；羊抗兔Ⅱ型胶原单克隆免疫抗体（DAKO，Oncogene TM，美国）、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（DAKO，Carpinteria，美国）。

组织处理仪 （Shandon，UK）、组织切片机（Slee Mainze，USA）、光学显微镜（Nikon ECLIPSE E600，日本）、恒温 CO2培养箱（Forma Scientific，美国）、超净工作台（上海博迅实验器材公司）、普通台式离心机（TDL-40B，上海安亭医疗仪器厂）、倒置相差显微镜（Nikon ECLIPSE TS100，日本）。

1.2 实验分组

对照组：低糖DMEM培养基 （含10%胎牛血清，青霉素、链霉素各100 U/mL）；实验组：低糖DMEM+bFGF培养基（含10%胎牛血清，青霉素、链霉素各 100 U/mL，bFGF 5 ng/mL）。

1.3 hBMSCs分离培养及扩增

标本离心管中加入含10%FBS低糖DMEM培养液约40 mL，混匀制成细胞悬液，1 800 r/min离心10 min，轻轻吸除脂肪及大部分上清液，震荡，细胞重悬，接种于100 mm培养皿，置于37℃、5%CO2、100%饱和湿度培养箱中培养，5 d后首次换液。待细胞80%～90%融合时，0.25%胰酶消化，收集细胞悬液，1 500 r/min 离心 5 min，计数，按 0.5×106个有核细胞接种于100 mm培养皿。实验组使用加bFGF的培养基，对照组使用不加bFGF的培养基。3～4 d后细胞可达到80%～90%的融合度，再次传代培养。两组细胞均传代至第4代，每次传代时观察细胞形态变化，并计算细胞得率。

1.4 hBMSCs聚集体的形成（pellets）

取第3代的 hBMSCs制成0.4×106cells/mL的细胞悬液，将1 mL的细胞悬液移到15 mL的离心管中用于制成一个pellet，1 080 r/min离心 5 min，细胞在离心管底部形成一细胞团。弃上清后，加入成软骨诱导液，每周换液2次，培养3周后行Ⅱ型胶原染色。

1.5 确定适和hBMSCs体外软骨构建的细胞代次

在上述实验基础上，取原代hBMSCs用DMEM+bFGF培养基进行培养，1∶3传代培养至第8代，观察各代次细胞形态变化；取第1～6代细胞制备pellet，体外成软骨诱导培养3周后，行大体观察并进行Ⅱ型胶原染色。

2 结果

2.1 两组培养体系中hBMSCs的形态变化

光镜下观察到实验组细胞呈长梭型，边缘较锐利，折光度增加，第1～4代细胞形态维持较好；对照组细胞生长较为缓慢、稀疏，第3、4细胞胞体增大，折光度差（图1）。

2.2 两组hBMSCs的细胞得率

本实验中hBMSCs扩增基数均为 0.5×106个有核细胞，两组第1代细胞扩增无明显差异。第2～4代中，实验组得率均高于对照组（P＜0.05），表明bFGF可维持细胞良好形态，更有利于细胞增殖（图2）。

2.3 两组hBMSCs的pellet和组织学观察

实验组pellet体积明显大于对照组，呈瓷白色，略有光泽，有弹性；对照组弹性较差。Ⅱ型胶原染色显示，实验组可见黄色沉积和均匀的软骨陷凹；对照组只有中间一部分黄染，周围未见软骨陷凹。提示bFGF对hBMSCs向软骨分化有促进作用（图3）。

2.4 DMEM+bFGF组连续传代下细胞形态

观察每一代细胞传代后第2天的细胞状态，发现第1~5代细胞呈长梭形，保持成纤维样细胞生长；从第6代开始，细胞铺展，细胞胞体变大呈星形、多边形，呈现明显老化状态（图4）。

2.5 DMEM+bFGF组连续传代下的组织学观察

Ⅱ型胶原染色显示，第1～4代的软骨基质中都可见黄色沉积和均匀的软骨陷凹；第5代染色稍淡，但仍能看到明显的软骨形成；第6代染色偏淡，软骨形成差（图 5）。

图1 hBMSCs在两种培养体系下连续传代培养的形态学观察（40×）Fig.1 Morphologicalobservation of hBMSCs under successively passaged culture in two expansion systems(40×)

图3 两种不同体系的pellet大体观及II型胶原染色比较Fig.3 Gross view and collagenⅡimmunohistochemical staining of hBMSCs'pellets in two expansion systems

图4 各代次hBMSCs在DMEM+bFGF体系中连续传代培养下的形态学观察（40×）Fig.4 Morphological observation of hBMSCs under successively passaged culture in DMEM+bFGF expansion system(40×)

图5 各代次pellet大体观及II型胶原染色观察Fig.5 Gross view and collagen II immunohistochemical staining of hBMSCs'pellets of each passage

3 讨论

基于组织工程技术进行软骨缺损修复已进入临床转化的关键阶段。作为最具临床应用前景的种子细胞之一，如何获取足量的BMSCs以满足大规模临床应用的要求，仍需在大动物实验的基础上，以hBMSCs进行验证[10]。

本实验首先探讨了bFGF临床应用的必要性。bFGF有较强的促细胞增殖的作用，对BMSCs的促增殖作用已在动物实验中得到证实[11]。本实验进一步以hBMSCs为对象进行研究。结果显示，在低糖DMEM+bFGF培养基中，第1～4代细胞呈长梭形，细胞量多，体积无明显改变；而在低糖DMEM培养基中，细胞从第3代即开始铺展、体积变大、排布稀疏；两组除第1代的细胞得率无明显差异外，DMEM+bFGF组第2～4代的细胞得率均明显高于DMEM组。表明bFGF对hBMSCs的促增殖作用与动物实验结果一致。pellet法可排除传统组织工程方法中支架材料的干扰，因此，本实验以pellet法验证bFGF对hBMSCs成软骨能力的影响[12]。结果表明，DMEM+bFGF培养体系下所构建pellet的体积为DMEM培养体系的2倍以上，且再生软骨均质，具有典型的软骨陷凹；而DMEM培养体系下所构建pellet体积小，再生软骨不均质，仅局部可见典型的软骨陷凹。提示bFGF培养体系下，hBMSCs具有更强的成软骨能力，在软骨再生临床转化中具有十分重要的应用价值。

虽然已有大量BMSCs用于软骨缺损修复的研究，但是大部分研究所用细胞代次为第3代，究竟哪些代次的BMSCs适用于软骨构建尚无系统研究[13]。本实验在验证bFGF应用必要性的基础上，进一步探讨了细胞代次对BMSCs软骨再生能力的影响。细胞形态显示，第1～5代细胞呈长梭形，保持成纤维样细胞生长；从第6代开始，细胞铺展，细胞胞体变大呈星形、多边形，呈现明显老化状态。成软骨能力评价结果表明，第1～6代构建了不同体积的pellet，均呈瓷白色，第1～4代细胞再生软骨均质，并具有典型的软骨陷凹，P第5代细胞再生软骨不均质、仅局部区域具有软骨陷凹，而第6代细胞再生组织无典型软骨陷凹形成。提示bFGF体系下培养细胞在第1～4代仍保持良好的软骨再生能力，第5代及后续代次细胞软骨再生能力较差。与常用的第3代细胞相比，本研究为hBMSCs临床应用的细胞代次选择提供了更多借鉴。

综上所述，bFGF可明显促进细胞增殖，并在保持hBMSCs软骨再生能力方面具有重要作用，因此在hBMSCs软骨再生中的临床应用中是必要的。同时，bFGF体系下，第4代之前代次的细胞软骨再生能力良好，第5代及后续代次细胞软骨再生能力较差，故建议以第1~4代BMSCs开展临床应用。

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Experimental Study of the Impacts of bFGF on Proliferation and Chondrogenesis of Human Bone Marrow Stromal Cells

ZHAO Dandan1,2,3,TAO Ran2,3,LIU Yu2,3,CAO Yilin2,3,ZHOU Guangdong1,2,3．1 Plastic Surgery Research Institute,Weifang Medical College,Weifang 261042,China;2 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;3 National Tissue Engineering Center of China,Shanghai 200241,China.Corresponding author:ZHOU Guangdong(E-mail:guangdongzhou@126.com).

ObjectiveTo explore the effect of basic fibroblast growth factor (bFGF)on the proliferation and chondrogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells (hBMSCs),and to determine the cell generation schedule suitable for in vitro cartilage construction of hBMSCs.MethodshBMSCs were obtained and cultured respectively in two culture systems:DMEM and DMEM+bFGF.Two groups of cells were repeatedly passaged to P4 generation,the morphological changes and cell yield rates of hBMSCs were compared between the two groups.At the same time the two groups of P3 cells were induced forchondrogenic differentiation using pelletculture for3 weeks in vitro.Gross observation,immunohistochemical staining of collagenⅡwere used to evaluate the results of each group.Based on the study mentioned above,the DMEM+bFGF culture group was subcultured to P8 to observe the morphological changes of each subculture.After chondrogenic differentiation using pellet culture for 3 weeks in vitro,gross observation and immunohistochemical staining of collagenⅡwere evaluated as before.ResultsThe cell morphology,cell yield and cartilage differentiation in DMEM+bFGF group was far greater than that of DMEM group.Under the culture system of DMEM+bFGF,cells passaged at 1∶3 could still maintain a good cell morphology in P6 generation.Immunohistochemistry showed that cartilage-specific extracellular matrix typeⅡcollagen was expressed better in P1-4 generation.ConclusionbFGF can significantly promote the proliferation andchondrogenesis of hBMSCs.P1-4 generation cells in DMEM+bFGF culture system is suitable for in vitro cartilage construction.

Basic fibroblast growth factor;Bone marrow stromal stem cells; Cell generation; Cartilage regeneration

Q813.1+2

A

1673－0364（2017）06－0318－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.06.004

261042 山东省潍坊市 潍坊医学院整形外科研究所（赵丹丹，周广东）；200011 上海市 上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科，上海市组织工程研究重点实验室（赵丹丹，陶然，刘豫，曹谊林，周广东）；200241 上海市 组织工程国家工程研究中心（赵丹丹，陶然，刘豫，曹谊林，周广东）。

周广东（E-mail：guangdongzhou@126.com）。

2017年10月11日；

2017年10月28日）