Aggrecanase-2表达沉默对体外培养的软骨细胞基质代谢的影响

王正辉 杨壮群 吴宝俊 常会敏 Kamal Mustafa 卢晓云

Aggrecanase-2表达沉默对体外培养的软骨细胞基质代谢的影响

王正辉 杨壮群 吴宝俊 常会敏 Kamal Mustafa 卢晓云

目的 探讨RNA干扰蛋白聚糖酶-2（Aggrecanase-2）对大鼠肋软骨细胞基质代谢的影响。方法 体外分离培养大鼠肋软骨细胞，采用脂质体转染试剂将针对Aggrecanase-2的载体质粒转染软骨细胞，观察转染后细胞生长曲线、细胞形态的变化；RT-PCR检测Aggrecanase-2 mRNA水平的变化；Western Blot检测蛋白多糖（Aggrecan）的变化。结果RNA干扰Aggreanase-2对细胞生长速度及形态无明显影响，可明显降低Aggrecanase-2的mRNA表达水平（P<0.05），增加Aggrecan的含量（P<0.05）。结论 抑制Aggrecanase-2可减少蛋白多糖的降解，RNAi是一种有效的研究软骨细胞基质代谢的工具。

软骨细胞 蛋白聚糖酶-2 RNA干扰

先天性畸形或后天获得性疾病导致的软骨组织缺损，如耳、鼻、气管的缺损或畸形等，严重影响患者的颜面外观或器官功能。软骨是一种无血管的组织，自身修复能力有限。软骨组织的来源主要以自体、同种异体和异种软骨移植物为主。其中，同种异体软骨为仅次于自体软骨的良好生物材料，其成本低、来源广泛且生物学性能良好的优点，使其目前在临床上应用较多，效果良好，临床成功率可达90%以上[1－2]。同种异体软骨移植后，软骨细胞外基质（ECM）发生大量的降解，尤其在移植后1个月内最为明显，表现为基质中蛋白多糖（Aggrecan）和胶原的含量发生较大的变化[1-3]。目前研究认为，Aggrecan的丢失可能是软骨代谢失衡的始动环节。因此，采用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术下调软骨细胞多聚蛋白聚糖酶（Aggrecanase）的表达，减少其对Aggrecan的分解，将有可能保持软骨移植后软骨细胞外基质的平衡，从而维持软骨的稳定，减少软骨的吸收。

本实验以大鼠Aggrecanase-2为靶基因，设计针对Aggrecanase-2特异性的小干扰RNA，并将该载体转染软骨细胞，观察其对细胞基质代谢的影响。

1 材料和方法

1.1 实验材料与仪器

慢病毒载体试剂盒（上海康成生物公司）；核酸内切酶BamHⅠ、核酸内切酶EcoRⅠ（TaKaRa公司）；T4 DNA连接酶（MBI公司）；凝胶回收试剂盒（QIAGEN公司）。雌性SD大鼠（西安交通大学医学院动物中心），1 月龄，体质量（120±10）g。 DMEM 培养基、胎牛血清、脂质体LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）；胰蛋白酶（Sigma公司），Ⅱ型胶原酶、透明质酸酶、阿尔新蓝8GX（Sigma公司）；小鼠抗大鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体（Neomarker公司）；羊抗大鼠Aggrecan单克隆抗体（Santa Cruz公司）；DAB免疫组织化学试剂盒（北京中杉公司）；RNA提取试剂盒（上海飞捷公司）；Revertaid First strand CDNA synthesis kit（MBI公司）。正置、倒置相差显微镜及显微摄影系统（Nikon公司）；CO2培养箱等。

1.2 大鼠肋软骨细胞的分离与培养

参见文献[4]的方法。清除附着于软骨的其他组织，将软骨切成1 mm3的小粒。0.05%透明质酸酶10 mL室温下消化20 min，弃去酶液，D-Hanks’液洗涤后，将软骨小粒转入离心管内，加入0.2%胰蛋白酶5 mL，于37℃磁力搅拌下消化30 min。再加入0.2%胶原酶5 mL，于37℃振荡消化过夜，吸出含细胞酶液，200目筛网过滤消化后的细胞悬液，所得细胞沉淀重悬于含10%胎牛血清DMEM培养基中。按2×104cells/cm2的密度，将上述细胞悬液接种于25 cm2的培养瓶，37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养；24 h后更换培养液，以后培养基每2 d更换1次。

1.3 ShRNA重组表达载体的构建[5]

按GenBank数据库大鼠Aggrecanase-2 mRNA（XM_341154）序列，根据RNAi设计原则设计，挑选3段长19 bp的特异性寡核苷酸为靶序列，命名为ag gre-21043-1061、aggre-21229-1247和 aggre-22293-231，阴性对照为aggre-2neg。

1.4 脂质体介导的软骨细胞转染

将第1代软骨细胞接种于6孔板内，待细胞长至80%～90%融合时转染构建的载体质粒。按照LipofectamineTM2000说明书进行。实验分组为：空白对照、干扰组、阴性对照组。

1.5 MTT法检测细胞增殖

将细胞按每孔2×104个细胞接种于24孔板，每孔100 μL，37℃、5%CO2条件下培养。 为避免血清干扰，培养细胞时用小于10%的血清培养；分别于转染24 h、48 h、72 h、96 h 和 120 h 时，弃掉各孔培养基，加入 MTT（5 mg/mL）20 μL，另加 180 μL 无酚红DMEM 37℃继续孵育4 h；吸去混合液，每孔加入DMSO 200 μL，震荡10 min使结晶充分溶解。在酶联免疫仪上490 nm处测定光吸收值，记录结果。

1.6 RT-PCR法检测转染重组质粒后Aggrecanase-2的表达[6]

按照试剂盒说明提总RNA，使用cDNA逆转录反应试剂盒进行逆转录反应，将反转录的cDNA按照以下体系（25 μL体系）进行PCR扩增。

β-actin引物序列：正义链5'-GAGGGAAA TCGTGCGTGAC-3'；反义链 5'-TAGGAGCCA GGGCAGTAATCT-3'；反应条件是 94 ℃ 2 min，94 ℃30 sec，53 ℃ 30 sec，72 ℃ 30 sec，循环 35 次。

Aggrecanase-2引物序列：正义链5'-CTGC GCTGTGATTGAAGATGAT-3'；反义链 5'-TGCTGGT AAGGATTGAAGACATT-3'；反应条件是94℃2 min，94 ℃ 30 sec，53 ℃ 30 sec，72 ℃ 30 sec，循环 35 次。反应产物于1%凝胶中进行电泳。凝胶成像系统对各电泳条带的吸光度进行分析，得出Aggrecanase-2 mRNA的相对表达量。

1.7 Western Blot检测转染后Aggrecan的表达

转染后48 h，加入单去污细胞裂解液，在4℃以12 000 r/min离心3 min，取上清，用 Lowry法定量蛋白，经聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离蛋白，用电转法将蛋白转置 PVDF膜上，依次加入封闭液、抗Aggrecan抗体、辣根过氧化物酶标记二抗，再经化学发光剂反应，X线片压片曝光。

1.8 统计学方法

各取3个样本，每个样本重复3次。采用SPSS 10.0软件包，对实验数据进行配对t检验和组间方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT

各组质粒干扰后与对照组相比，细胞生长曲线无明显变化（图1）。

图1 各组质粒干扰后生长曲线Fig 1.The growth curve of chondrocytes by different plasmids

2.2 RNAi对Aggrecanase－2 mRNA水平影响

RT-PCR检测结果表明：细胞中各组泳道中βactin基因扩增片段条带的亮度强弱相似，说明RTPCR中加入的模板的量一致，而扩增的Aggrecanase-2基因电泳带存在明显差异。其中对照及阴性对照组PCR扩增带亮度较强，3组重组质粒载体中，RNAi后Aggrecanase-2表达与对照组相比，aggre-21043-1061表达量为对照组的 60%（P<0.05），aggre-21229-1247组为 71.64%（P<0.05），而 aggre-22293-2311对 Aggrecanase-2无明显抑制作用，阴性对照组对Aggrecanase-2也无明显影响，说明RNAi抑制的特异性（图2）。

抑制率=（相对灰度值对照组－相对灰度值实验组）÷相对灰度值对照组

图2 RT-PCR产物电泳及统计图（★★P＜0.01）Fig 2.RT-PCR results and graph of statistics(★★P＜0.01)

2.3 Western Blot分析

采用Western Blot检测干扰后的Aggrecan含量，发现aggre-21043-1061和aggre-21229-1247可明显增加Aggrecan含量，与对照组有统计学差异（P<0.05）（图3），与RT-PCR结果一致。

图3 Western-blot条带图Fig 3.The graph of Western Blot

3 讨论

同种异体软骨移植后，常发生免疫排斥反应，导致移植软骨被吸收和破坏。软骨组织是由少量细胞和大量基质成分组成的，具有抗原性，但其细胞外基质（ECM）能阻止分子量大于60 000的宿主大分子渗透、通过，隔离了软骨细胞与宿主间的大分子（如免疫球蛋白）之间的接触作用，形成了一道抗免疫反应屏障，保护和预防或延缓宿主免疫移植排斥反应，使软骨成为一种弱抗原组织。因此，维持软骨基质的质和量，对软骨移植物的存活显得非常重要。目前，减少软骨移植后的免疫排斥反应尚是难点问题。

杨壮群等[1-2]在同种异体软骨移植中发现，同种异体软骨移植后，软骨ECM大量衰退（尤其在移植后1个月内最为明显），主要表现为单核淋巴细胞的浸润导致蛋白多糖的大量降解，随后因MHCⅡ型分子的渗入使Ⅱ型胶原流失。软骨移植后基质的变化首先表现为蛋白多糖的丧失，这一软骨细胞外基质降解过程与骨关节炎的病理过程相类似。有关学者在研究类风湿性关节炎（RA）和退行性关节炎（OA）时发现，多聚蛋白聚糖的丢失是目前所知的关节软骨在关节疾病中最早发生的代谢变化，甚至早于关节软骨出现病理改变[7]。致病因素所导致的多聚蛋白聚糖的丢失，可视为软骨代谢失衡的始动环节，如持续存在，则引起关节软骨胶原纤维的降解和各种炎性信息因子的释放，引发瀑布效应，进而彻底打破关节软骨的代谢平衡，进入不可逆性的负代谢状态，最终导致关节软骨的损毁。因此，多聚蛋白聚糖的代谢改变和信息调控是研究软骨基质代谢障碍的关键所在。

参与多聚蛋白聚糖代谢的生物大分子很多，其中参与降解代谢的最重要的酶是多聚蛋白聚糖酶。Aggrecanases属于带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整连蛋白金属蛋白酶（A disintegrin and metalloproteinasewith thrombospondin motifs，ADAMTS）家族，主要降解软骨多聚蛋白聚糖，具有很高的特异性。其公认的成员只有两个，即Aggrecanase-1和Aggrecanase-2。Aggrecanase-2在新生关节软骨蛋白聚糖的代谢中起重要作用，并且在关节软骨受到病理损害时，对蛋白聚糖的降解、糖氨聚糖（Glycossminoglycan，GAG）的丢失起主要责任。目前，Aggrecan因其为软骨降解的始动因素而受到广泛的关注，Aggrecanases已成为减少软骨降解新的靶点[8]。

RNAi是一种序列特异性的转录后基因沉默现象。RNAi技术具有稳定性好、阻断效率高、特异性强的特点，现已成为操纵微生物和培养哺乳动物细胞基因表达的强有力工具。Ruohua等[9]采用RNAi技术应用于人软骨细胞，发现通过抑制ADAMTS可明显减少蛋白多糖的降解。本研究中，我们采用大鼠肋软骨细胞作为研究对象，发现表达shRNA的载体可明显抑制Aggrecanase-2的mRNA水平，并可增加Aggrecan含量，与对照组相比差异显著，aggre-21043-1061为最有效的RNA特异性抑制序列，同时观察到抑制Aggrecanase-2对软骨细胞生长速率无明显影响，为构建Aggrecanase-2受抑制的稳转细胞奠定了基础。

当然，软骨移植抑制后的免疫排斥反应是个复杂的过程，不仅与自身软骨组织、软骨细胞代谢情况相关，还与炎性因子等有关。此外，Aggrecanase-2、MMPs等降解酶活性状态启动的始动因素，可能涉及到诸多方面的问题。是否可通过抑制Aggrecanase-2而减少Aggrecan的降解，以减缓排斥反应的发生，尚需更深入的研究。

[1]郑信民,杨壮群,侯成群,等.同种透明软骨移植后蛋白多糖动态变化的实验观察[J].中华整形外科杂志,1995,11(2):129-131.

[2]侯成群,杨壮群,常晓峰,等.同种软骨移植后胶原含量变化的研究[J].中华整形外科杂志,1995,11(4):274-276.

[3]杨壮群,侯成群,常晓峰,等.同种软骨移植后基质动态变化的实验研究[J].中国美容医学杂志,1997,6(1):14-16.

[4]Wang ZH,Yang ZQ,He XJ.Lentivirus-mediated knockdown of aggrecanase-1 and-2 promotes chondrocyte-engineered cartilage formation in vitro[J].Biotechnology and Bioengineering,2010,107(4):730-736.

[5]Wang ZH,Yang ZQ,He XJ,et al.Effects of RNAi-mediated inhibition of aggrecanase-1 and aggrecanase-2 on rat costochondral chondrocytes in vitro[J].Acta Pharmacol Sin 2008,29(10):1215-1226.

[6]王正辉,李国光,杨壮群,等.大鼠肋软骨细胞体外培养及老化对基质代谢的影响[J].组织工程与重建外科,2007,3(6):312-316.

[7]Nagase H,Kashiwagi M.Aggrecanases and cartilage matrix degradation[J].Arithritis Res Ther,2003,5(2):94-103.

[8]Elizabeth CA,Michael AP,Carlp D,et al.Tortorella.Aggrecanase.A target for the design of inhibitors of cartilage degradation[J].Ann NY Acad Sci,1999,30(878):92-107.

[9]Song RH,Micky DT,Anne-Marie M,et al.Aggrecan degradation in human articular cartilage explants is mediated by both ADAMTS-4 and ADAMTS-5[J].Arthritis Rheum,2007,56(2):575-585.

Effects of Inhibiting Aggrecanase-2 Gene Expression by RNA Interference on Cultured Chondrocyte Extracellular Matrix in Vitro

WANG Zhenghui1,YANG Zhuangqun2,WU Baojun1,CHANG Huimin1,Kamal Mustafa3,LU Xiaoyun4.1Department of Otolaryngology-Head&Neck Surgery,The Second Affiliated Hospital,Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710004,China;2 Department of Plastic and Burns Surgery,The First Affiliated Hospital,Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710061,China;3 Faculty of Dentistry,University of Bergen,Norwa;4 Department of Biological Science and Bioengineering,School of Life Science and Technology,Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710049,China.

ObjectiveTo evaluate the effect of RNAi mediated aggrecanase-2 on rat costochondral chondrocytes extracelluler matrix.MethodsRat costochondral chondrocytes were obtained by microdissection and digestion,and cultured in monolayer.The growth velocity and morphological changes of chondrocytes were observed after transfection.The mRNA of aggrecanase-2 expression was detected by RT-PCR method and aggrecan content was detected by western blot.ResultsThe specific inhibition of aggrecanase-2 by RNAi had no positive effect on the morphology and growth velocity of the chondrocytes.The express of mRNA of aggrecanase-2 was decreased significantly.RNAi significantly increased the aggrecan content of chondrocytes treated.ConclusionInhibition of aggrecanase-2 may decrease aggrecan degradation.RNAi technology can be a useful tool for studying degenerative processes in cartilage.

Chondrocyte;Aggrecanase-2;RNA interference

Q786

A

1673－0364（2012）05－0245－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.05.002

国家自然科学基金（81000416）；中央高校基本科研业务费专项资金（西安交通大学国际合作类，交叉学科类）；西安交通大学第二附属医院人才培养基金[RC(XM)201102]；西安交通大学第二附属医院重点项目基金[YJ(ZD)201103]。

710004 陕西省西安市 西安交通大学第二附属医院耳鼻喉-头颈外科（王正辉，吴宝俊，常会敏）；710061 陕西省西安市 西安交通大学第一附属医院整形烧伤科（杨壮群）；挪威卑尔根大学牙科学院（Kamal Mustafa）；710049 陕西省西安市 西安交通大学生命科学与技术学院（卢晓云）。

吴宝俊（E-mail:ehui4298@163.com）。

2012年8月5日；

2012年8月22日）