ADAM10在小鼠颅面部膜内成骨过程中的表达

谭宇 傅润卿 房兵 杨秩

颅面部骨骼发育过程中，大部分骨骼包括额骨、顶骨、枕骨、上颌骨（除颅底软骨）、下颌骨（除髁突软骨）都是以膜内成骨的方式形成。既往研究表明，膜内成骨受多种分子和信号通路调控[1]，但具体机制仍不清楚。解聚素样金属蛋白酶10（A Disintegrin and metalloproteinase，ADAM10）是跨膜蛋白ADAM家族的一员。典型的ADAM10蛋白结构包括N端信号序列、金属蛋白酶域、整合素域、富半胱氨酸域、跨膜域和胞内域。不同功能结构域可能参与不同的生理功能，包括蛋白水解和细胞信号传导，以及参与细胞黏附和细胞融合[2-4]。肿瘤相关研究表明，ADAM10在肿瘤发生与增殖中起调控作用。ADAM10过表达可促进口腔鳞状细胞癌的癌细胞生长，而下调其表达则能降低癌细胞生长[5]。ADAM10基因敲除小鼠可因心血管系统发育紊乱，在胚胎第9.5天死亡，中枢神经系统发育异常[6]；继而在小鼠神经干细胞中条件性敲除ADAM10基因，小鼠大脑皮层发育出现异常，表现为神经元的分化和迁移异常[7]。提示ADAM10可能在不同发育阶段和不同生理状态下，参与了不同的生理调控过程。本实验探讨ADAM10在颅面部骨组织发育过程中的表达变化规律及亚细胞定位，揭示颅面部膜内成骨机制，进一步阐明颅面部骨骼发育的分子调控机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、材料及仪器

C57BL/6小鼠由斯莱克公司提供，饲养于上海交通大学附属第九人民医院SPF级实验动物房 [实验动物使用许可，SYXK(沪)2012-0007]。小鼠胚胎发育时间按检到阴栓的当日中午定为0.5 d计算。本实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》。

抗 ADAM10抗体（Abcam公司，英国）；Hoechst（碧云天生物技术研究所，中国）；抗GM130抗体（Sigma公司，美国）；驴抗小鼠、驴抗兔荧光二抗（Invitrogen，美国）；阿辛蓝、茜素红染剂（Sigma 公司，美国）；HRP 耦联二抗（Santa Cruz公司，美国）；组织裂解液（RIPA）（碧云天生物技术研究所，中国）；胎牛血清（Gibco 公司，美国）；DMEM/F12 培养基（Gibco公司，美国）。

荧光显微镜（Nikon，日本）；PCR 扩增仪（罗氏公司，瑞士）。

1.2 小鼠下颌骨骨组织冰冻切片制备

E17.5胚胎小鼠置于冰上处死，心包灌注冲洗，4%多聚甲醛灌注固定。蔗糖多聚甲醛梯度脱水，4℃保存。待胎鼠完全沉底后，切取头颅用OCT胶整体包埋，连续冰冻切片，选取合适位置的切片，60℃烘烤30 min，冷却至室温，-20℃保存。

1.3 阿辛蓝-茜素红染色

冰冻切片置于60℃烘箱中烘烤30 min。冷却至室温后，阿辛蓝染料染色10 min，清水漂洗10 min，茜素红染色过夜，清水漂洗10 min。乙醇梯度脱水，二甲苯透明后中性树脂封片。置通风橱吹干后，光学显微镜观察并摄片。

1.4 组织切片免疫荧光

切片置于60℃烘箱中烘烤10 min，冷却至室温，摇床上用PBS清洗3次，每次10 min。将PBS吸干净，切片水平置于湿盒内，加入一抗（1∶100）4℃孵育24 h。PBS清洗3次，每次10 min。将PBS吸干净，切片水平置于湿盒内，加入二抗 （1∶2 000）及Hoechst（1∶2 000），避光 37 ℃孵育 2 h，PBS 避光清洗3次，每次10 min。甘油封片后置于-20℃保存，激光共聚焦显微镜观察并摄片。

1.5 MC3T3细胞系免疫荧光

细胞爬片用盐酸乙醇处理，烤干后置于24孔板中。MC3T3细胞至对数生长期时，消化离心重悬并计数，按每孔1×105个接种于24孔板。隔日用PBS清洗1次（5 min）。4%多聚甲醛-4%蔗糖-PBS固定15 min，PBS清洗 3次，每次 15 min。0.3%Triton-5%BSA-PBS 封闭打孔 1 h。加入一抗（1∶500）4 ℃过夜，PBS 清洗 3 次，每次 15 min。 室温孵二抗（1∶2 000）及 Hoechst（1∶2 000），2 h，最后用 PBS 清洗 3 次，每次15 min。用Fluorescence-G封片，激光共聚焦显微镜观察并摄片。

1.6 小鼠下颌骨骨组织蛋白样本制备及蛋白免疫印迹法检测ADAM10蛋白含量

取 E17.5、P0（出生后 0 天小鼠，Postnatal3）、P3、P7及成年小鼠的下颌骨骨组织，于液氮中研磨，加蛋白裂解液置于冰上30 min，离心后取上清液，测量蛋白浓度后加入蛋白上样液和DTT制备组织蛋白样本。用9%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白。5%脱脂奶粉封闭 1 h后，加入一抗（1∶1 000）4℃孵育过夜，GAPDH作内参。TBST清洗3次，每次10 min，加标记 HRP的二抗 （CST，1∶2 000） 室温孵育 2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，显影。

1.7 统计学分析

应用SPSS13.0进行统计学处理，采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠发育早期颅面部膜内成骨区域

阿辛蓝-茜素红染色显示P3小鼠鼻中隔、下颌骨梅克尔软骨和前颅骨等区域膜内成骨明显。可见在鼻中隔软骨旁有明显新骨形成；而在下颌梅克尔软骨外围，可见茜素红染色区域，提示膜内成骨活跃区域紧贴梅克尔软骨支架。而前颅骨在此时基本已经已经钙化成骨（图1）。

图1 P3小鼠发育颅面部骨骼膜内成骨区域Fig.1 Intramembranous ossification regions in P3 mice

2.2 ADAM10在小鼠骨组织中的表达定位

为进一步定位ADAM10在颅面膜内成骨过程中的表达，我们选取E17.5小鼠头颅冠状切片行免疫荧光组织化学染色，发现ADAM10在颌面部膜内成骨区域，如鼻中隔、下颌骨梅克尔软骨和前颅骨均高表达，呈现部位特异性。且可见在梅克尔软骨外围膜内成骨活跃区域，ADAM10表达明显增高，而在梅克尔软骨区域表达较低；在鼻中隔旁成骨活跃区域及鼻黏膜中均高表达；而在鼻中隔软骨区域表达相对较低（图2）。

图2 ADAM10在小鼠骨组织中的表达定位。Fig.2 Expression of ADAM10 in mice mandibular and nasal septum

2.3 ADAM10在前成骨细胞系MC3T3中的表达

三标免疫荧光技术提示，ADAM10广泛分布在胞浆中，在质膜和细胞核附近表达高；其胞核附近的高表达信号与高尔基体共标，提示其可能在高尔基体中加工后至细胞膜发挥功能（图3）。

图3 ADAM10在前成骨细胞系MC3T3中的表达Fig.3 Expression of ADAM10 in MC3T3 cell line

2.4 ADAM10在小鼠下颌骨膜内成骨过程中的表达变化

为研究ADAM10在颅面膜内成骨过程中的表达变化规律，我们选取小鼠下颌骨区域行免疫印迹研究，可以见到ADAM10存在两个条带，一个是85 KDa的前体形式，一个是剪切后形成的激活形式，分子量约70 KDa。可以看到在E17.5、P0、P3和P7，ADAM10非激活形式和激活形式均高表达，但是在成年小鼠中ADAM10表达明显下降，表明ADAM10主要在颅颌面骨骼发育早期高表达，提示其可能参与了成骨过程（图4）。

图4 ADAM10在小鼠下颌骨膜内成骨过程中的表达变化Fig.4 Expression of ADAM10 in mice mandibular during intramembranous ossification

3 讨论

本实验结果证实，ADAM10在颅面部骨骼发育过程中呈现时空表达的规律性变化，在发育早期高表达，成年后表达明显减低，并主要定位于膜内成骨活跃区域。提示ADAM10可能参与调控小鼠颅面部骨骼膜内成骨过程，为进一步研究ADAM10在膜内成骨中的调控机制提供了实验基础。

颅面部的骨骼系统通过膜内成骨和软骨内成骨两种机制成骨。软骨内成骨主要见于髁突软骨及颅底软骨黏合。而更主要的形式是膜内成骨，其发生与颅面部绝大部分骨骼的形成有密切关系，如前颅骨、鼻上颌复合体、下颌骨。因此，本实验主要关注颅面膜内成骨区域。通过阿辛蓝-茜素红染色，发现成骨活跃区域主要集中在下颌骨梅克尔软骨外围，鼻中隔软骨外侧以及颅顶骨骼，与文献报道类似[1]。

梅克尔软骨在下颌骨体部膜内成骨中的作用一直存在争议。一种观点认为，梅克尔软骨主要起支持作用，与下颌骨体部膜内成骨无直接关系，随着胚胎发育，梅克尔软骨细胞凋亡、吸收而后消失[8]；另一种观点认为，梅克尔软骨参与下颌骨体部的形成。Ishizeki等[9]发现，梅克尔软骨的钙化始于其碱性磷酸酶阳性的软骨膜，软骨膜钙化成骨是下颌骨体部膜内成骨的一个标志。本实验发现，在梅克尔软骨四周，即软骨膜附近ADAM10表达最高，提示ADAM10可能参与了梅克尔软骨膜区成骨。在前颅骨，ADAM10主要表达在前颅骨表层骨膜细胞、成骨细胞、骨细胞成骨活跃的区域，进一步提示ADAM10在膜内成骨过程中可能发挥了极其重要的作用。

MC3T3是小鼠胚胎前颅骨成骨细胞系，常在体外实验中用来研究膜内成骨机制[10]。本实验发现，ADAM10在MC3T3细胞中高表达，并广泛分布在胞膜及胞浆中；在胞核旁的高表达区域与高尔基体共标，提示其可能在高尔基体中进行修饰，最后转运至细胞膜上，以膜蛋白的形式发挥作用。这与以往的研究结果相类似，也提示ADAM10可能以膜蛋白的形式发挥功能。

作为一种重要的膜蛋白，ADAM10主要通过对其底物的剪切修饰，从而活化相关信号通路，调控相应的生理功能。比如Notch信号通路，ADAM10通过剪切Notch受体，形成胞内段 （Notch intracellular domain，NICD），继而转运入核，激活其下游基因的表达。在转基因小鼠前成骨细胞高表达Notch1-ICD，可出现骨体积下降的骨质缺乏[11]；而转基因小鼠成熟成骨细胞高表达Notch1-ICD，出现生长停滞的骨骼功能紊乱，由于不成熟的成骨细胞增殖旺盛导致骨量增加和骨硬化[12]。以上结果提示，ADAM10可能通过调控Notch信号通路调控骨发育过程，然而，这一假说需要进一步的实验论证。

4 结论

解聚素样金属蛋白酶10（ADAM10）广泛表达在小鼠颅面部膜内成骨活跃的区域。ADAM10在小鼠胚胎期、新生期和成年期的不同表达量，提示ADAM10可能参与调控膜内成骨中成骨细胞分化的过程，为进一步揭示颅面部膜内成骨机制提供了有益信息。

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