乳腺生物反应器在生物制药领域的研究进展

谢晶莹，张 勇，冯若飞

(1.西北民族大学 生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030；2. 甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070；3. 甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃 兰州 730030)

动物生物反应器是利用转基因活体动物，在其器官或组织中高效表达某种外源蛋白，并进行工业化生产功能蛋白质的技术.根据目的蛋白表达部位的不同，可分为乳腺、血液、蛋清、尿液、精囊腺、唾液腺等生物反应器[1].由于乳腺有高表达重组蛋白以及翻译后修饰的能力[2]，乳腺生物反应器是目前国际上惟一证明可以达到商业化的生物反应器.首例转基因动物是通过将DNA注射到小鼠胚胎中，然后将胚胎植入雌性小鼠子宫产生的[3].但真正的乳腺生物反应器研究则始于1987 年Gordon 等的工作.Gordon 等[4]首次构建转基因小鼠乳腺生物反应器，并成功表达提取出组织型纤溶酶原激活剂( tPA).此后一批以转基因动物为核心技术的生物制药公司相继建立，例如荷兰Genpharm 公司和美国GTC公司.Genpharm 公司用转基因牛生产乳铁蛋白，而GTC 公司用山羊乳腺生物反应器生产的重组人抗凝血酶Ⅲ( ATryn) ，成为首个在欧洲药监局和美国FDA 相继获准上市的生物工程药物.乳腺生物反应器是一种全新的生产模式.与需要特定培养环境以及培养基的哺乳动物细胞表达系统相比，其最大的优势在于能够得到高产量，并且具有天然构象的蛋白质，而且成本低廉[2].这些优点使其在生物医药行业具有更广阔的应用前景.本文仅对乳腺生物反应器的原理、优势，在生物制药领域的应用以及未来的应用前景等方面做一简要综述.

1 乳腺生物反应器的原理

乳腺生物反应器(mammary gland bioreactor)是指利用哺乳动物乳腺特异性表达，并通过乳腺的正常分泌作用，以期从转基因动物乳汁中获取重组蛋白的一种生物反应器[5].乳腺反应器的原理是将编码活性蛋白的基因导入动物的受精卵或早期胚胎内，以制备转基因动物，利用雌性动物产仔后乳腺分泌乳汁的特点，利用乳蛋白基因的乳腺特异性调控元件驱动外源基因在动物乳腺中的高效表达，从而在乳汁中源源不断地获得外源性蛋白[6].

2 乳腺生物反应器的优势

与利用微生物或细胞发酵生产药用重组蛋白的传统技术相比，转基因动物乳腺生物反应器具有不可比拟的优势.①乳腺生产药用重组蛋白产量高、成本低、易纯化.哺乳动物的乳腺是高度分化的腺体，具有超强的蛋白质合成能力，尤其是经过改良后的动物品系，其乳腺的蛋白质合成能力更强.现有研究报道，动物乳腺中表达外源蛋白的含量可高达g/L[7].分离纯化是乳腺生物反应器研制成功后，投入规模化生产的下游关键步骤.由于乳汁中蛋白质种类相对较少，因此更易于药用重组蛋白分离纯化，且生产工艺简单[8].②表达产物可被充分修饰且生物活性稳定.哺乳动物乳腺细胞相对于原核生物及酵母具有更完善的翻译后修饰和加工能力，从而能保证表达产物在生化组成，结构及生物学功能等方面最大限度地接近天然蛋白[9].③ 无环境污染.乳腺生物反应器在产品的生产和纯化过程中没有毒性物质或有害物质释放[10].④转基因动物乳腺生物反应器技术对动物自身的伤害小.哺乳动物的乳腺是个相对封闭的分泌系统，能有效地防止其特异性表达的重组蛋白进入循环系统，因而对转基因动物健康的伤害很小.⑤乳腺生物反应器的产业具有巨大市场潜力和巨额利润.GTC 公司上市的ATryn 预计每年市值7亿美元.另据美国红十字会分析，人血清白蛋白(HSA) 、人纤维蛋白原( hFIB) 、人蛋白C ( hPC) 、人凝血因子hF-Ⅷ和hF-Ⅸ的市场潜力年估值均在几亿和十几亿美元之间[11].

3 乳腺生物反应器的应用

目前，乳腺生物反应器的主要应用有以下三个方面：第一是生产药用蛋白；第二是建立转基因动物的生物反应器；第三是提高乳品质.

3.1 生产药用蛋白

抗凝血酶Ⅲ (Antithrombin Ⅲ，AT Ⅲ) 是血浆中最重要的一个抗凝血酶因子，在维持血液的凝血与抗凝血平衡中起重要作用.青岛森淼实业有限公司开展了利用崂山奶山羊乳腺生物反应器制备药用蛋白的研究工作，建立了乳腺生物反应器的开发平台，其中利用乳腺生物反应器生产rhAT Ⅲ已经达到大规模生产的要求[12].

蛋白C，又称凝血酶原IIA和凝血因子XIV，其活化形式在调节人及其他动物的抗凝血、炎症、细胞死亡和维持血管壁通透性等方面起着重要作用[13].活化蛋白C (Activated Protein C，APC) 因其活性部位含有丝氨酸残基而被归类为丝氨酸蛋白酶[14].在人类中，蛋白C是由PROC基因编码的，该基因存在于2号染色体上[15].人蛋白C (hPC) 是一种维生素K依赖的血浆糖蛋白，具有抗凝血活性，由25 KD轻链和41 KD重链组成[16].已有多种宿主表达系统用来生产重组hPC. Macias WL等应用HEK293细胞生产rhPC用于脓毒症的治疗[17]. 转基因猪乳腺也被用来生产重组hPC.乳腺细胞生产的重组蛋白易于纯化，而且表达量优于其他表达系统[18，19].

人凝血因子VIII 对缺乏人凝血因子VIII所致的凝血机能障碍具有纠正作用.其主要用于防治由凝血因子VIII(FVIII)缺陷引起的出血性疾病，如甲型血友病.Wang Q 等应用转基因小鼠乳腺生物反应器高效并特异性表达了人重组凝血因子VIII.通过对比两种不同启动子的重组表达载体P1A3-hFVIIIBD 和 CMV-hFVIIIBD在小鼠乳汁中蛋白表达水平以及蛋白活性，发现P1A3-hFVIIIBD更适用于在乳腺生物反应器中生产hFVIII[20].

人体组织型纤溶酶原激活剂(tPA)是纤维蛋白溶解的关键激酶，溶解纤维蛋白凝块以促进血栓溶解过程中起到重要作用.虽然tPA是目前临床上用于治疗血栓疾病的主要生物药品之一，但其存在着不可避免的缺点，如出血副作用较大、半衰期短等[21].Song SZ等成功构建了重组人纤溶酶原激活剂的转基因兔乳腺生物反应器，而且表达的蛋白是分泌到乳汁中的.乳汁中rhPA 表达水平可达到15.2～630 μg/mL.经纤维蛋白琼脂糖平板检测显示rhPA具有强溶栓生物活性，最高的比活性是药品阿替普酶的360倍[22].

乳铁蛋白具有抗菌和抗炎的特性.已有研究成功地在牛乳腺上皮干细胞表达牛乳铁蛋白(LF cinB)并应用于牛乳腺炎的治疗[23].人乳铁蛋白(hLF)是一种多功能糖蛋白，参与肠道和非特异性免疫系统的铁吸收[24].Cui CC等应用乳腺β-乳球蛋白敲除(BLG-)的山羊作为转基因动物反应器来大规模生产人乳铁蛋白，通过ELISA检测，来自BLG-/hLF山羊的乳汁中的hLF表达水平较BLG/HLF山羊乳汁水平高，而且差异呈显著性[25].Dai Y等对乳腺生物反应器表达的重组人乳铁蛋白的毒性做了相关研究.急性口服毒性试验表明，rhLF在观察期内没有毒性作用，重组人乳铁蛋白小鼠急性口服LD50大于20000 mg/kg.90天喂养试验表明，300次rhLF推荐剂量后，动物体内无明显不良反应，毒理学参数NOAEL为10.00 g/(kg·d).这一研究结果也表明，rhLF不存在食品安全隐患[26].

人溶菌酶具有杀菌消炎、免疫调节、改善肠道菌群等作用，也是人体的非特异性免疫物质和母乳重要成分，食用、药用均安全可靠，无免疫原性，可广泛应用于食品保鲜、婴幼儿奶粉、抗菌消炎药和抗生素替代等方面，具有广阔的应用前景.人溶菌酶转基因动物研究的最终目的是获得抗仔猪腹泻的猪、抗乳房炎的奶牛和奶山羊来获取大量有生物活性的重组人溶菌酶，以用于食品和医学临床研究[27-30].

干扰素α-2b(IFNα-2b)是重要的免疫调节剂，临床上广泛用于治疗慢性肝炎、慢性粒细胞白血病和多发性骨髓瘤等.临床上使用的IFNα-2b通常是原核表达系统生产的重组蛋白[31].其存在一定的缺陷：除缺乏翻译后O-糖基化以及血清半衰期短之外，E.coli表达的重组蛋白多存在于包涵体中.复性过程中有近50%的蛋白损失，这也是生物技术行业公认的技术瓶颈[32，33].Hui Li等应用转基因小鼠乳腺生物反应器成功表达了具有生物活性的人干扰素α-2b，弥补了原核表达系统的不足.但其高表达及低成本的特性也为干扰素α-2b的生产提供了新的途径[34].

人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)是一种糖蛋白，主要由内毒素、TNF-α和IFN-γ活化单核—噬细胞产生.rhG-CSF作用于造血祖细胞，刺激粒细胞、单核巨噬细胞成熟，并促进成熟细胞向外周血释放[35，36].Mashkani B等应用毕赤酵母表达系统成功表达了去内毒素并具有生物活性的人CSF-1[37].Batista RI等应用转基因山羊生物反应器，使其成功地在乳汁中分泌表达.该研究证明rhG-CSF可以在第一代(F1)转基因山羊的乳腺中表达[38].

纵观乳腺生物反应器表达的产物，从最初的抗凝血酶Ⅲ( A Tryn)、人蛋白C (h PC)、凝血因子Ⅷ(h F-Ⅷ) 到组织型纤溶酶原激活剂(tPA)、乳铁蛋白(hLF)、溶菌酶、超氧化物歧化酶(SOD)[39]、干扰素α-2b和集落刺激因子.可见转基因动物乳腺生物反应器生产的都是一些医用价值高的酶或细胞因子等.

3.2 建立转基因动物生物反应器

自从转基因动物技术发展以来，转基因动物的乳腺就被用作反应器来生产重组药用蛋白[40，41].用于乳腺生物反应器研究的物种主要是小鼠[4]，此外还有其他产奶动物，如绵羊[42]、山羊[43]、牛[44]、猪[45]和兔[22]等.有研究表明，已在山羊乳腺成功表达抗凝血酶原III[46]，而且在转基因兔中成功表达了以生理活性形式存在的超氧化物歧化酶[47].

3.3 提高乳品质

通过乳腺生物反应器改良乳品质有两方面内容：一是表达一些外源营养蛋白提高乳汁本身的营养价值，降低有害物质的含量；二是改变乳汁中原有成分，从而使乳汁或乳制品更有利于人类健康.以乳铁蛋白为例，其是牛奶中一种具有广谱抗菌活性的多功能蛋白质，可以抵抗多种细菌、真菌、病毒以及寄生虫感染[48].它的抗菌活性也使得其可以替代传统药物用于牛乳腺炎的治疗.但是牛奶中该蛋白的表达量明显低于人乳，因此在牛乳腺中表达相关重组蛋白会使牛乳更接近于人乳，有利于人类健康[40].Zhang JX等人，采用质粒介导的基因转移技术使乳腺细胞合成和分泌牛乳铁蛋白和牛抗菌肽预防牛乳腺炎[49].

4 结语

虽然转基因动物乳腺生物反应器技术已经取得了一些成就，展示了广阔的发展潜力和前景.可广泛应用于实际生产，但还是仍存在许多理论和技术问题需要解决，如外源基因在动物体内的整合位点问题、转基因表达产物的后期分离纯化问题、目的基因的翻译后修饰问题以及外源基因在动物乳腺中特异性表达的问题.尽管这一技术还存在一些问题，但它实实在在创造了一个新的现代生物医药产业.它仍然是一种理想的药用蛋白的生产工具，有着不可比拟的优势，将成为现代生物医药领域改革的方向.其具有巨大的经济价值和广阔的应用前景.