HPLC法测定沙棘籽粕中槲皮素山柰酚和异鼠李素的含量

任梅娟，卢永昌，辛青霞，李 欣

(1.青海民族大学 药学院，青海 西宁 810007；2.青海省青藏高原植物资源化学研究重点实验室，青海 西宁 810007；3.青海省药物分析重点实验室，青海 西宁 810007)

沙棘( Hippophae rhamnoides L.) 为多年生落叶灌木或小乔木，是一种喜光、耐水、耐旱、生长性极好的小浆果植物，多为橘黄色或橘红色[1].我国主要分布在西北、华北、东北及西南等十多个省区，全国约有100 万 hm2[2].现代科学研究表明，沙棘果与沙棘籽富含蛋白质、氨基酸、有机酸、多种维生素以及微量元素等对人体有益的功能活性成分和营养成分，具有独特的保健功能和药用价值，享有“绿色黄金”的美誉[3].沙棘中的黄酮含量较高，主要是异鼠李素、槲皮素、山奈酚、杨梅素等黄酮苷元及其苷类.据报道，国外已分离出的沙棘黄酮类化合物有32种[4]，是因为这些丰富的黄酮类化合物，沙棘才具有了如治疗心脑血管疾病(心肌缺血、心肌再灌注损伤、血栓)、抗癌、抗氧化、抗衰老、降血脂、降血糖、心脏保护等药理作用[5].目前，工业上采用超临界萃取沙棘油后，剩余的沙棘籽粕多为废弃物.企业每年有大量沙棘籽粕无法处理，为探索沙棘籽粕的再利用，本试验采用高效液相色谱法，测定了沙棘籽粕中槲皮素、山柰酚、异李鼠素三种黄酮甙元，获得了满意结果，可为沙棘籽粕的二次开发提供依据.

1 材料

1.1 仪器

Agilent1100高效液相色谱仪(配二极管阵列检测器)；十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；SZ—97自动三重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)；FW7362M/24电子分析天平(德国制造)；KQ-3200超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司).

1.2 药品与试剂

沙棘籽粕购自青海康普德生物制品有限公司.

甲醇为色谱纯，购自山东禹王实业有限公司禹城化工厂；磷酸等均为分析纯.

槲皮素(100081-201507)、山柰酚(110861-201504)、异鼠李素(110860-201406)三种对照品购自中国药品生物制品检定所.

2 方法和结果

2.1 色谱条件

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm).流动相：含0.04%磷酸的甲醇∶水=50∶50.流速：1 mL/min.检测波长：360 nm.柱温：35 ℃.在此色谱条件下槲皮素、山奈酚、异鼠李素等3种成分均被洗脱出来，并且达到基线分离，见图1.

2.2 溶液的制备[6]

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取对照品槲皮素2.24 mg、山柰酚1.41 mg、异鼠李素2.20 mg，将其分别置于5 mL的容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，再配制成一定浓度对照品溶液，使用时稀释成所需要的浓度.

2.2.2 供试品Ⅰ溶液(未水解样品)的制备

精密称取1.0 g，加入甲醇10 mL，超声提取45分钟，抽滤.以甲醇洗涤滤渣3次，每次2 mL.滤渣重复上述操作，所得滤液与前一次滤液合并，浓缩后定容至50 mL.过0.45 μm滤膜，在所选定色谱条件下测定有效成分的含量.

2.2.3 供试品Ⅱ溶液(水解样品)的制备

精密称取1.0 g，加入甲醇10 mL，超声提取45分钟，抽滤，以甲醇洗涤滤渣3次，每次2 mL.滤渣重复上述操作，所得滤液与前一次滤液合并，浓缩一定体积后，加甲醇-25%盐酸溶液(4∶1)混合液25 mL，回流30 min，放冷，转移至50 mL量瓶中，加入甲醇定容，过0.45 μm滤膜，在所选定色谱条件下测定有效成分的含量.

2.3 线性关系试验

分别精密量取3种对照品储备液，用甲醇配制成浓度不同的混合对照品标准液系列溶液，每次进样10 μL，测定色谱峰面积的积分值.以峰面积积分值(A)为纵坐标，以进样量X(μg)为横坐标，测得槲皮素、山奈酚、异鼠李素的回归方程，见表1.

表1标准曲线

2.4 检测限

在选定的色谱条件下，当信噪比S/N=3时，对各组分最低检测限进行测定.结果表明，测定槲皮素、山奈酚、异鼠李素含量的最低检测限分别为0.25、0.38、1.2 ng.

2.5 精密度试验

在选定的色谱条件下，量取一定浓度的槲皮素、山奈酚和异鼠李素的混合对照品溶液，测定色谱峰的峰面积，计算得RSD分别为0.64%、0.49%、0.92%(n=6).

2.6 重复性试验

在选定的色谱条件下，精密称取沙棘籽粕样品0.5 g平行6份，分别加入甲醇10 mL，超声提取45分钟，抽滤.以甲醇洗涤滤渣3次，每次2 mL.滤渣重复上述操作，所得滤液与前一次滤液合并，浓缩后定容至50 mL.过0.45 μm滤膜，分别测定槲皮素、山奈酚、异鼠李素的含量，计算得RSD分别为1.4%、2.3%、2.7%(n=6).

2.7 稳定性试验

在选定的色谱条件下，精密称取沙棘籽粕样品0.5 g，分别加入甲醇10 mL，超声提取45分钟，抽滤.以甲醇洗涤滤渣3次，每次2 mL.滤渣重复上述操作，所得滤液与前一次滤液合并，浓缩后定容至50 mL.过0.45 μm滤膜，在2 h、4 h、8 h、12 h、24 h时分别进样，计算槲皮素、山奈酚、异鼠李素的峰面积，计算得RSD分别为0.7%、0.9%、0.45%(n=5).表明样品溶液在24 h内稳定性良好.

2.8 回收率试验

精密称取5份已测知含量的沙棘籽粕样品各0.5 g，添加各对照品溶液适量，按“2.2”方法操作，测得槲皮素、山奈酚、异鼠李素平均回收率(n=5)分别为100.7%、98.7%、99.6%；RSD分别为2.6%、3.1%、1.2%，结果见表2.

表2回收率试验结果(n=5)

2.9 样品含量测定

在选定的色谱条件下，取“2.2”项下制备的样品溶液，用DAD(二极管阵列)检测器检测上述3种待测组分的峰纯度.待3种紫外光谱与对照品一致后，按外标法，计算峰面积积分值，从而计算得3种有效成分的含量.每个样品重复进样3次，取其平均值.含量测定结果见表3.

表3沙棘籽粕中3种有效成分的含量(%，n=3)

3 讨论

3.1 检测波长的确定

将对照品溶液进样后，利用DAD(二极管阵列)检测器在波长200～400 nm范围扫描对照品溶液吸收光谱.3种对照品在238 nm波长处均有较高的吸收，而且干扰比较小，因此选择238 nm为检测波长.

3.2 流动相的选择

经过多次试验，3种有效成分色谱峰容易拖尾.当水中加入0.04%磷酸时可改善3种有效成分峰的拖尾现象，因此选择甲醇和含0.04%磷酸的水作流动相.

3.3 结论

沙棘籽粕中黄酮类化合物主要有槲皮素、山奈酚、异鼠李素及其与各种糖形成的黄酮苷.水解与不水解样品中各种组份的含量，发现水解与否对组份的含量的影响较小(见表3).为了简化操作步骤，可采用不经水解直接测定的方法.

通过测定发现沙棘籽粕，仍含有较高的槲皮素、山奈酚、异鼠李素等黄酮类化合物.沙棘籽粕可作为制备黄酮化合物的中间体或原料，可进一步提高沙棘籽粕的经济价值.

本文采用方法具有简便、快速、准确、可靠等特点，为沙棘籽粕的综合利用提供了依据.同时该方法可用于沙棘及其产品的质量评价.

[1] 张程慧，祁玉霞，程康蓉等.沙棘的综合价值研究进展[J].食品工业科技，2017，38(21)：331-335.

[2] 郭兴.利用沙棘果渣栽培黑木耳的研究[J].林业科技，2017，42(1)：42-44.

[3] 赵二劳，徐芬，尹爱萍等.沙棘果油与沙棘籽油脂肪酸组成及其抗氧化活性[J].中国油脂，2017，42(12)：120-123.

[4] 樊旭，周鸿立.沙棘黄酮含量的测定方法及其化学成分的研究进展[J].北方园艺，2018，(06)：120-123.

[5] 刘勇，廉永善，王颖莉等.沙棘的研究开发评述及其重要意义[J]中国中药杂志，2014，39(9)：1547-1551.

[6] 宋永朋，马华丽. HPLC法测定白刺籽中槲皮素和山萘酚的含量[J].食品研究与开发，2015，36(20)：131-133.