人源化IGF-Ⅰ基因的人工合成、重组与表达

李向茸，王兴陇，李 倩，邓盈盈，梁浩勤，周 飚，冯若飞*

(1.西北民族大学 生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030；2.甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃 兰州 730030；3.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030)

胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors，IGF)，又称类胰岛素生长因子、生长激素介质，是生长激素产生生理作用过程中必需的一种活性蛋白多肽物质.血清中含有多种胰岛素样生长因子，现今发现存在10种IGF-Ⅰ，其中包括7种哺乳动物和3种非哺乳脊椎动物的IGF-l[1].IGF-Ⅰ是一种受生长激素(GH)调节的单链碱性多肽，由70个氨基酸组成，分子量为7 649 Da，含3个二硫键.IGF-l基因定位于人类第12号染色体q23.2，由6个外显子和5个内含子组成.IGF-Ⅰ的主要生物功能为促进各种细胞的生长、分化及蛋白质合成[2-3]，是GH功能作用中的重要辅助调节因子[4].血清中游离IGF-Ⅰ还具有类似胰岛素的降血糖活性作用[5-6].由于IGF-Ⅰ为全身性生长因子，临床上可以通过测定血清中的IGF1的表达水平作为2型糖尿病、肿瘤、胃癌、乳腺癌等的诊断指标[7-11].血浆中IGF-Ⅰ含量不高，且95%以上的IGF-Ⅰ会与结合蛋白形成复合物[12]，如果直接从血浆中提取、纯化，技术难度较大.本试验根据大肠杆菌的偏爱密码子设计并合成人IGF-Ⅰ核苷酸序列，并将其克隆到载体pUC57中，然后构建重组表达载体pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ.通过IPTG优化诱导条件在E.coli中与GST蛋白实现融合可溶性表达，并利用建立的间接ELISA检测方法对表达的hIGF-Ⅰ进行鉴定，为进一步实现hIGF-Ⅰ的基础研究和药物开发提供依据.

1 材料

1.1 菌株、载体

大肠杆菌BL21菌株、表达载体 pGEX-6P-1，均由西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室提供.

1.2 主要试剂

质粒提取试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)；1 000 bp plus DNA Ladder(中科瑞泰生物科技有限公司)；限制性内切酶BamH Ⅰ、SalⅠ、Prestained Protein Ladder等均购自(Fermentas公司)；凝胶回收试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司)；50×TAE(上海生工生物工程有限公司)；T4 DNA连接酶(宝生物工程大连有限公司)；IPTG(GIBCO公司)；琼脂糖ARAROSE G-10(GENE Company公司)；IGF-Ⅰ、兔抗IGF-Ⅰ IgG(北京博奥森生物技术有限公司)；辣根化物酶标记的羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司).

1.3 主要仪器

SW-CJ-1F生物洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；YLN-2000凝胶数字成像系统(北京市亚力恩机电技术研究所)；ZWY-2102C立式恒温振荡摇床(上海智城分析仪器制造有限公司)；GNP-9160隔水式恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)；6132生物分光光度计(Eppendorf公司)；PowerCycle SL 96 Gradient PCR扩增仪(Biometra公司)；PowerPac Basic电泳仪(Bio-rad公司)；WD-9405D脱色摇床(北京六一仪器厂)；MK3酶标仪(美国Thermo Fisher公司).

2 方法

2.1 hIGF-Ⅰ基因的设计与合成

将GenBank上hIGF-Ⅰ核苷酸序列(A29117.1)进行密码子优化，并将合成的基因克隆到载体pUC57上，插入位点为SmaⅠ，由上海生工生物工程有限公司合成.序列优化结果如下：5′-ggatccATGTTTGCGACTGCACGTGGATCCATGTTCCCGGCTATGCCACTGTCTTCCCTGTTTGTAAATGGACCGAGGACGCTCTGCGGGGCTGAGCTGGTGGATGCTCTTCAGTTCGTGTGTGGAGACAGGGGCTTTTATTTCAACAAGCCCACAGGGTATGGCTCCAGCAGTCGGAGGGCGCCTCAGACAGGTATGGTGGATGAGTGCTGCTTCCGGAGCTGTGATCTAAGGAGGCTGGAGATGTATTGCGCACCCCTCAAGCCTGCCAAGTCAGCTGTCGACCGCAACGGTTTCTCTCCGgtcgac-3′(小写字母序列为双酶切位点，下划线部分为上、下游引物).

2.2 重组表达载体pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ的构建

分别用BamH I +Sal I双酶切上述克隆载体pUC57-hIL-7和表达载体pGEX-6P-1，之后分别进行纯化，然后用T4 DNA连接酶连接、转化大肠杆菌BL21菌株，单克隆培养后提取质粒，依次进行PCR、酶切及测序鉴定.测序鉴定完全正确的质粒命名为pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ.

2.3 重组蛋白的诱导表达及优化

2.3.1 IPTG诱导表达

将测序鉴定正确的pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ质粒重新转化大肠杆菌BL21菌株，挑取单克隆菌斑37 ℃、200 r/min培养10 h.吸取上述菌液及pGEX-6P-1菌液各160 μL，分别加入至8 mL新鲜Amp+LB培养液中，37 ℃、200 r/min摇菌约100 min，待OD600值为0.4时，向诱导组中加入40 μL诱导剂 IPTG(IPTG的终浓度为0.5 mmol/L)后，37 ℃、200 r/min继续培养9 h.

2.3.2 表达产物的SDS-PAGE

取出菌液1 mL，12 000 r/ min离心1 min收取菌体沉淀.加入0.01 mmol/L PBS重悬100 μL后，再加入100 μL的2×SDS上样缓冲液，95 ℃变性5 min.分别取出10 μL上述处理的样品进行SDS-PAGE电泳，然后用0.25 %考马斯亮蓝染色，经过脱色处理，分析蛋白表达情况.

2.3.3 不同诱导条件的优化

分别吸取pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ的单克隆菌液100 μL，加入到6个平行的5 mL Amp+ LB培养液中，37 ℃、 200 r/min摇菌培养.于三组不同的菌浓度(OD600值为0.2、0.4、0.8)时加入不同浓度的IPTG(0.5 、1.0 mmol/L)，进行表达条件的优化.将以上菌液均在37 ℃、200 r/min摇菌9 h，之后分别以2.3.2步骤进行SDS-PAGE检测.

2.4 表达产物的ELISA检测

2.4.1 包被与封闭

用pH值为 9.0的0.05 mol/L碳酸盐缓冲液(包被缓冲液)将表达产物hIGF-Ⅰ(已知抗原)及阳性对照IGF-Ⅰ fragment稀释至10 μg/mL.每个聚苯乙烯板的反应孔中加100 μL，4 ℃过夜.次日洗涤1次，然后每孔加入封闭液(洗涤液+13%马血清)150 μL，置室温封闭2 h.甩掉封闭液并拍干，室温晾干.

2.4.2 加入一抗及酶标二抗

用 PBST 25倍稀释兔抗IGF-Ⅰ制的 1∶25稀释兔抗IGF-Ⅰ，选两孔每孔加入100 μL一抗.再选两孔每孔加入100 μL PBST作阴性对照，37 ℃水浴1 h，取出用PBST洗涤5次并拍干.然后加入1∶10 000稀释的羊抗兔酶标二抗(稀释液为含13%马血清的PBST)，每孔100 μL，37 ℃水浴45 min.

2.4.3 加入显色液及终止液

用PBST洗涤5次并拍干.于各反应孔中加入显色剂A溶液(H2O2)、B溶液(TMB)各50 μL，37 ℃水浴避光显色15 min.于各反应孔中加入2 mol/L硫酸50 μL.在酶标仪上，于主波长450 nm、次波长630 nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD450/630值，若大于或等于规定的阴(-)性对照OD450/630值的2.1倍，即为阳(+)性.

3 结果与分析

3.1 重组表达载体pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ的构建

重组表达载体pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ的构建结果见图1.

M. 1 000 bp plus DNA Ladder；1. pGEX-6P-1；2. pUC57-hIGF-Ⅰ双酶切鉴定；3. pUC57-hIGF-Ⅰ；4. pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ；5. pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ的双酶切鉴定；6. pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ的PCR鉴定.

由图1可知，重组表达载体pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ经BamHⅠ+SalⅠ双酶切后，出现2条清晰的电泳条带，约为4 900 bp和240 bp.PCR鉴定在240 bp处出现一条明亮的条带，均与预期相符.测序结果进行BLAST比对，与GenBank上的人IGF-Ⅰ核苷酸和氨基酸序列同源性均为100%，表明重组表达载体pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ构建成功.

3.2 重组蛋白的诱导表达及优化

重组蛋白的诱导表达及优化结果见图2、图3.

M. Prestained Protein Ladder；1. 未诱导pGEX-6P-1-IGF-Ⅰ；2. 诱导pGEX-6P-1；3. 诱导pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ.

由图2可知，经IPTG诱导，pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ组在34 ku附近出现一条染色较深的蛋白带，分子质量大小与理论值相符，表明hIGF-Ⅰ蛋白被成功诱导表达.

M. Prestained Protein Ladder；1. OD600值为0.2，IPTG浓度为0.5 mmol·L-1；2. OD600值为0.4，IPTG浓度为0.5 mmol·L-1；3. OD600值为0.8，IPTG浓度为0.5 mmol·L-1；4. OD600值为0.2，IPTG浓度为1.0 mmol·L-1；5.OD600值为0.4，IPTG浓度为1.0 mmol·L-1；6. OD600值为0.8，IPTG浓度为1.0 mmol·L-1.

图3不同诱导条件的优化结果

由图3可知，在OD600值为0.8、IPTG浓度为0.5 mmol/L的条件下，电泳条带最明显.因此，图3中的诱导条件为最佳诱导条件.

3.3 表达产物的ELISA检测

生物分光光度计测定表达蛋白的浓度2.811 mg/mL，将表达产物hIGF-Ⅰ及阳性对照IGF-Ⅰ均稀释至5 μg/mL包被酶标板.

表1 hIGF-Ⅰ重组蛋白的ELISA检测结果

由表 1可知，表达产物有抗原活性，但相比阳性对照活性较低.

4 讨论与结论

hIGF-Ⅰ基因组含有5个内含子和6个外显子，其中成熟hIGF-Ⅰ肽链由3、4外显子进行编码，4种hIGF-Ⅰ前体分子由3、4外显子与其他几种外显子拼接所形成[13]，因此天然hIGF-Ⅰ的核苷酸序列不易利用反转录法获得.目前，针对小分子蛋白质及多肽的编码基因主要利用化学合成法获取.hIGF-Ⅰ仅含有70个氨基酸，为小分子蛋白.它与GST可以实现融合表达，且26 ku的GST标签蛋白可用凝血酶、Xa因子和PreScission蛋白酶进行去除，方便进行下游纯化.因此，实验采用人工合成的hIGF-Ⅰ基因，可成功构建重组表达载体pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ，并能实现其在大肠杆菌中与GST蛋白的融合可溶性表达.并在此基础上进行不同菌浓度和IPTG浓度的优化，得出的最佳诱导条件OD600值为0.8、IPTG浓度为0.5 mmol/L，表达蛋白的浓度为2.811 mg/mL，且产物具有抗原活性.鉴于IPTG造价高昂并对人体存在一定的毒性，部分国家明确规定禁止IPTG使用于人用重组生物制剂的生产工艺中，因此在生产hIGF-Ⅰ工艺中可考虑选用无毒、廉价的乳糖作为tac启动子的诱导剂[14].

IGF-Ⅰ从发现到现在已经有40多年的历史，它是一种重要的生物资源，在国际上已经逐渐成为一种高效益的技术产业，但其研究成果更积极的意义在于创新药物研究[15].目前，天然的IGF-Ⅰ已用于治疗多种顽疾并取得较好的临床效果.随着社会与经济发展，人们对健康要求不断提高，对新药的需求也与日俱增，重组的IGF-Ⅰ具有良好的应用前景[16].本试验中重组质粒pGEX-6P-1-hIGF-Ⅰ虽在大肠杆菌中成功表达，但通过ELISA检测表达的目的蛋白相对于阳性对照IGF-Ⅰ的OD450/630值较低.这说明其表达产物浓度较低且生物活性不高，因此对于提高重组载体的表达产率和可溶性蛋白产率等问题有待于进一步探索.

[1] 朱红杰，张彦华，张亿虹，等. 胰岛素样生长因子的研究进展[J]. 黑龙江医药，2007，20(3)： 200-203.

[2] GOMI K，TANG Y，ARBELAEZ V，et al. Endothelial cell mediated promotion of ciliated cell differentiation of human airway basal cells via insulin and insulin-like growth factor 1 receptor mediated signaling [J]. Stem Cell Rev，2017，13(2)： 309-317.

[3] LEE H T，CHANG H T，LEE S，et al. Role of IGF1R+ MSCs in modulating neuroplasticity via CXCR4 cross-interaction [J]. Sci Rep，2016，6： 32595.

[4] LARON Z. Insulin-like growth factor 1(IGF-Ⅰ)： a growth hormone [J]. Mol Pathol，2001，54(5)： 311-316.

[5] 张艳红，冯明. 老年2型糖尿病合并代谢综合征患者血清抵抗素水平与胰岛素抵抗的关系研究[J]. 中国全科医学，2012，15(2)： 167-169.

[6] SALINERO-FORT M A，BURGOS-LUNAR C，LAHOZ C，et al. Performance of the Finnish diabetes risk score and a simplified Finnish diabetes risk score in a community-based，cross-sectional programme for screening of undiagnosed type2 diabetes mellitus and dysglycaemia in Madrid，Spain： the SPREDIA-2 study [J]. PLoS One，2016，11(7)： e0158489.

[7] 闫红娟，陈涛. C反应蛋白、肿瘤坏死因子、白细胞介素及胰岛素样生长因子检测在2型糖尿病患者中的意义[J]. 国际检验医学杂志，2017，38(3)： 344-346.

[8] 王立新，王元松，田风胜，等. 复荣通脉胶囊对糖尿病大鼠心肌组织胰岛素样生长因子-1表达的影响[J]. 河南中医，2017，38 (1)： 72-76.

[9] 李小勤，钱增堃，朱文娟，等. 胰岛素和胰岛素样生长因子与肿瘤的相关性研究进展[J]. 临床与实验病理学杂志，2018，34 (1)： 77-79.

[10] 张海峰，申兴斌，刘莎莎，等. 下调胰岛素样生长因子-1表达对人胃癌细胞增殖和侵袭及迁移的影响[J]. 中华肿瘤防治杂志，2017，24 (1)： 16-22.

[11] 刘保华，万舰，余婉燕，等. 胰岛素样生长因子-1、生长激素与乳腺癌相关性研究[J]. 中国妇幼卫生杂志，2017，8(6)： 1-5.

[12] SATO A，NISHIMURA S，OHKUBO T，et al. Three-dimensional structure of human insulin-like growth factor-I (IGF-I) determined by 1H-NMR and distance geometry [J]. Int J PePt Protein Res，2009，41(5)： 433-440.

[13] BALARAM S K，AGRAWAL D K，ALLEN R T，et al. Cell adhesion molecules and insulin-like growth factor-1 in vascular disease [J]. J Vasc Surg，1997，25(5)：866-876.

[14] 张毅，屈贤铭，杨胜利. 乳糖作为诱导剂对重组目的蛋白表达的影响[J]. 生物工程学报，2000，16(4)： 464-468.

[15] 吴岚晓. 人胰岛素样生长因子1基因的克隆、表达及产物纯化鉴定[D]. 广州： 中国人民解放军第一军医大学，2000.

[16] 刘姝. 胰岛素样生长因子-1的克隆、表达及纯化[D]. 大连： 大连理工大学，2006.