全氟辛烷磺酸对大型蚤的慢性毒性研究

沈洪艳，杨杰频，曹志会，王 冰，赵 月

(1．河北科技大学环境科学与工程学院，河北石家庄 050018；2．河北省药用分子化学重点实验室，河北石家庄 050018)

全氟辛烷磺酸对大型蚤的慢性毒性研究

沈洪艳1，2，杨杰频1,2，曹志会1，王 冰1，赵 月1

(1．河北科技大学环境科学与工程学院，河北石家庄 050018；2．河北省药用分子化学重点实验室，河北石家庄 050018)

采用大型蚤21天暴露和子代21天恢复实验法，研究了PFOS对大型蚤的慢性毒性效应及其子代F1(1st)和F1(3rd)的恢复情况。结果显示：PFOS质量浓度高于20 mg/L时，F0代总产卵量、终点体长和内禀增长率都受到显著抑制。3个指标在最高浓度组与空白组相比，依次降低了62.2%，40.6%，34.0%(p<0.01)。随PFOS暴露浓度增加，其对大型蚤毒性逐渐加重，PFOS暴露浓度与对大型蚤毒性之间具有明显的剂量-效应关系。当PFOS质量浓度高于30 mg/L时，F1(lst)代总产卵量和终点体长受到显著抑制。F1(3rd)代比F1(1st)代大型蚤恢复程度更好，除暴露于50 mg/L的总产卵量、终点体长和内禀增长率仍受显著抑制，其他指标都恢复到接近空白组水平。大型蚤总产卵量、终点体长和内禀增长率作为最敏感的指标，建议将其用于评价PFOS的慢性毒性。

全氟辛烷磺酸；大型蚤；恢复实验；慢性毒性

全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate，PFOS)是一种典型的表面活性剂，最早由美国3M公司成功研制[1]。PFOS是至今发现的性能最优异的表面活性剂[2]，由于其表面活性高、耐热性高和化学稳定性高，自然条件下很难水解、光解和生物降解[3]，可用于高温作业或与强酸、强碱接触的作业，因而在产品包装涂层、杀虫药剂、印刷、半导体以及纺织品、皮革制品和电镀等工业得到广泛应用。然而，大范围的使用导致了全球范围内的广泛分布和残留。特别是由于PFOS挥发性小而水溶性大，生产废水属于高浓度有机废水[4]，排放后易驻留在水环境当中[5]，并能通过生物的浓缩、食物链的传递影响高等动物和人类健康。相关动物实验显示每天2 mg/kg的PFOS摄入量即可导致死亡，因此被定义为耐久性的有机污染物为世界各国环保组织所禁用[6-8]。PFOS含氟烃基既憎水又憎油[9]，在动物体内易附着在血液和肝脏中的蛋白质上。毒理学研究表明，PFOS具有生殖毒性、神经毒性以及对性腺、甲状腺的干扰作用[10]。研究表明重金属污染是中国水体污染的主要问题[11]，但是金一和等研究表明中国境内水环境中也普遍存在着PFOS污染[12]。因此研究PFOS对水生生物慢性毒性效应，可以为风险评价提供科学依据，研究意义重大。

本研究选取国际公认的标准实验生物大型蚤作为受试生物，采用21天暴露实验法，研究PFOS对大型蚤母代及其子代第1胎和第3胎：F1(1st)和F1(3 rd)在21 d恢复期的慢性毒性效应。实验指标终点体长和繁殖情况(每个母蚤产幼蚤数、第1次怀卵和产卵的天数、每个母蚤的胎数)是用来评价个体的参数，而内禀增长率(r)是用来评估种群的参数。本研究以期为揭示PFOS对水生生物的环境毒性和受害机制提供科学依据，了解不同指标的敏感程度，为今后选择恰当的指标预测PFOS对水蚤种群的影响提供数据支持。

1 材料与方法

1.1实验材料

1)实验生物

本实验受试生物为大型蚤，取自南开大学。在1～2 L的鱼缸中，注入500～1 000 mL曝气3 d的实验室用水，再放入10～20个大型水蚤，在室内光照条件下进行培养。培养温度为15～25 ℃，pH值为7.5±0.5，溶解氧质量浓度为2 mg/L以上，硬度(以 CaCO3计)为(250±25)mg/L。采用实验室培养的斜生栅藻培养液喂养大型蚤，按1∶1(藻液与稀释水体积比，下同)或1∶2接种。每周全换培养液1～2次。

在显微镜下观察选择出怀卵量高的水蚤单独培养，投喂充足的饵料，在实验前24 h用孔径为1 mm的筛子将幼水蚤滤去，在实验前6～12 h进行第2次过筛，得到出生6～24 h的幼水蚤，将幼水蚤再继续培养2 d，即得出生72 h的实验水蚤。从中筛选健康、无病菌、有活力、没有受伤的幼蚤进行实验。

2)实验药品

PFOS(CAS：1763-23-1)，双蒸水。

3)实验设备

倒置显微镜，100 mL烧杯，BBC-226STV型Haier家用电冰箱(青岛海尔股份有限公司)；JPBJ-608型便携式溶解氧测定仪(上海精密科学与仪器有限公司)；FE20型pH计(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；微型温度计和水硬度计(WAD-TH)等。

1.2实验方法

1)大型蚤21天染毒实验

本实验参照OECD标准方法[13]，采用21天连续暴露法进行。急性毒性实验结果显示PFOS对大型蚤暴露的24 h LC50为150.34 mg/L(质量浓度，下同；95%置信区间为132.21～179.03)，72 h LC50为70.65 mg/L(95%置信区间为65.32～77.21)。本实验设置6个质量浓度梯度的PFOS，依次为0，10，20，30，40，50 mg/L。每个烧杯中盛放50 mL实验溶液，放1只出生6～24 h的幼蚤。设置1个空白组和10个平行组(暴露组)。实验期间采用半静态实验系统，24 h更换1次实验溶液，保证24 h内药品浓度为起始浓度的80%以上。期间用新鲜的栅藻喂养大型蚤。实验中及时分离出新出生的小蚤，把死亡的大型蚤用吸管挑出来，以免影响其他大型蚤的健康生长。记录大型蚤的繁殖情况。实验温度控制在(20±2) ℃，培养液中溶解氧应保持在80%饱和度左右。光暗比为14 h∶10 h，pH值为7.8±0.2。

2)子代21天恢复实验

分别选取每个实验处理组中母蚤所生的第1胎幼蚤F1(lst)和第3胎幼蚤F1(3rd)10只，即平行组(暴露组)10个，分别放在50 mL没有PFOS的培养液中(恢复期)，进行21天的恢复培养，其他条件与以上的慢性毒性实验相同。

实验期间每24 h观察1次，取出新生幼蚤，纪录母蚤蜕皮、死亡情况，第1次怀卵和产卵时间、第1次产卵数、成活率，以及整个实验过程中的产卵次数和总产卵量。将第1天的水蚤取出，在显微镜下测量其体长(从头盔至壳刺部的长度)。计算最终体长、大型蚤的净生殖率(R0)、内禀增长率(r)，计算方法见式(1)—式(3)。

R0=∑LXmX，

(1)

T=∑XLXmX/∑LXmX，

(2)

r=lnR0/T。

(3)

式中:LX为存活率；mX为大型蚤每次产幼蚤数；T为世代周期；X为天数。

1.3数据处理

慢性毒性实验数据采用Origin8.0软件进行数据处理和作图，用t检验法比较平行组(暴露组)与空白组之间的显著性差异，当t0.05时，可认为无显著性差异；当t0.05(n)≤t，即p<0.05时，可认为差异显著。

2 结果与讨论

本实验中F0代水蚤及其后代的生存未受到影响，但其繁殖受到显著抑制作用。第1胎F1(lst)和第3胎F1(3rd)的21天恢复实验中，未发现死亡蚤、雄蚤和冬卵现象。

2.1不同浓度PFOS的暴露下F0代大型蚤和子代21天恢复实验的生长和繁殖指标

在不同浓度PFOS的暴露下F0代大型蚤生长和繁殖指标的变化见表1。从表1中可以看出，大型蚤的各项指标都受到不同程度的影响。当PFOS质量浓度在40～50 mg/L时，各生长繁殖指标都受到显著抑制。PFOS质量浓度达到50 mg/L时，除总胎数外，其他各项指标均受到极显著抑制。受抑制最明显的就是总产卵量和终点体长2个指标。整个暴露组的总产卵量都受到显著抑制，PFOS质量浓度高于20 mg/L时，终点体长也受到了显著抑制，表明总产卵量和终点体长作为最敏感的指标，相对于其他指标更加适合用于衡量PFOS的慢性毒性。

表1 在不同质量浓度PFOS的暴露下F0代大型蚤生长和繁殖指标Tab.1 Growth and reproduction of the F0 generation exposed to different concentration of PFOS

注：*代表暴露组和空白组t检验差异显著，0.01

随PFOS暴露浓度的增加，大型蚤生长和繁殖受抑制的情况随之加重。暴露于10 mg/L的PFOS大型蚤的第1次怀卵时间为6.8 d，随着暴露浓度的增加第1次怀卵时间逐渐增长，与空白组的6.0 d相比增加了0.8～3.0 d。暴露于PFOS大型蚤第1次产卵时间比对照组增加了0.5～2.6 d，第1次产卵量降低了2.7～9.6枚。暴露组的总产卵量比空白组降低了12.6～83.2枚，终点体长降低了0.10～1.38 mm，这说明PFOS对F0代大型蚤的生长和繁殖都有比较严重的影响，并且随着PFOS暴露浓度的增加，该毒性效应趋于严重，形成明显的剂量-效应关系。刘晓玲研究也有相似发现，沐浴露对大型蚤的抑制效应与其浓度呈明显正相关关系[14]。

表2 F1(1st)代大型蚤在不同质量浓度PFOS暴露后的恢复实验中生长和繁殖指标的变化Tab.2 Growth and reproduction of the F1(1st) generation in the recovery testafter the F1 generation's exposure to different concentration of PFOS

注：*代表暴露组和空白组t检验差异显著，0.01

表2为F1(1st)代大型蚤在不同质量浓度PFOS暴露后的恢复实验中生长和繁殖指标的变化情况。从表中数据显著性分析可知，相对于F0代大型蚤，子代Fl(lst)在没有PFOS的影响下，其各项生长和发育指标都有所恢复。但与空白组相比较，仍有部分生长指标受到显著抑制。当PFOS质量浓度高于30 mg/L时，总产卵量和终点体长受到显著抑制。质量浓度小于40 mg/L时，其他各项指标与空白组没有显著差异。在其他毒物的研究中有相同结论，如叶伟红等研究表明，暴露于氟氯菊酯的母代大型蚤所产F1(1st)代在恢复实验中总胎数、第1次产卵时间和第1次产卵量与空白组基本没有差异，而终点体长和总产卵量仍受到显著抑制[15]。

暴露于PFOS的F1(1st)代大型蚤的总产卵量随着浓度的增加依次降低，范围为88.7～125.1枚，而F0代总产卵量为50.5～121.1枚，两者相比F1(1st)代受抑制作用明显有所恢复，但与空白组总产卵量132.6枚相比仍有很大差异。从表2可以看出其余各项指标均有逐渐恢复的趋势。这说明高浓度的PFOS通过母代大型蚤传递给子代。

表3 F1(3rd)代大型蚤在不同质量浓度PFOS暴露后的恢复实验中生长和繁殖指标的变化Tab.3 Growth and reproduction of the F1(3rd) generation in the recovery test after the F1 generation's exposure to different concentration of PFOS

注：*代表暴露组和空白组t检验差异显著，0.01

表3为F1(3rd)代大型蚤在不同质量浓度PFOS暴露后的恢复实验中生长和繁殖指标的变化情况。从表中可以看出，F1(3rd)代大型蚤在没有PFOS影响的情况下，其生长和毒性指标与F0代和Fl(lst)代大型蚤相比更加接近正常水平。说明虽然母代大型蚤受PFOS污染后生长繁殖明显受到毒性影响，但是子代在没有PFOS的环境中可通过自身代谢或者某些酶的调节，恢复健康状态。F1(3rd)代比Fl(lst)代恢复状况更良好，说明晚期产的子代比早期产的子代恢复能力更强，这可能是因为母代大型蚤逐渐适应了PFOS的暴露环境，在暴露后期通过本能的调节使得PFOS传递到卵中的残留量减少。戴朝霞等研究表明，大型蚤在毒物环境暴露初期耐受力降低，在暴露48～96 h后逐渐恢复[16]。但是在有些研究中得到了相反的结论：恢复实验中随着子代序列的增加，生长繁殖受抑制更为显著。如胡方华等的研究表明，三唑酮对于第2代大型蚤，染毒的影响比对第1代的影响更大[17]。这说明毒物在大型蚤世代中的富集效应与毒物本身性质有关。

但是PFOS质量浓度分别为40，50 mg/L时，总产卵量和终点体长2个指标仍受到显著抑制(0.01

2.2PFOS暴露下的大型蚤F0代及其F1(1st)代、F1(3rd)代在恢复期的内禀增长率

内禀增长率是一种生态指标，可以反映一个种群在无限制的环境中的生长趋势，是生物生存和繁殖两种能力的综合反映。内禀增长率降低的主要原因是种群繁殖能力下降。

图1 不同质量浓度PFOS暴露下的大型蚤F0代和F1(1st)代、F1(3rd)代在恢复期的内禀增长率Fig.1 Innate rates of increase of F0 generation exposed to different concentration of PFOS and F1(1st), F1(3rd) generations after recovery

图1为不同质量浓度PFOS暴露下的大型蚤F0代及其F1(1st)代、F1(3rd)代在恢复期的内禀增长率。从图中可以看出，暴露于20 mg/L的PFOS的F0代大型蚤内禀增长率为0.326，显著低于空白组(p<0.01)，其降幅为13.5%。暴露于40 mg/L和50 mg/L的PFOS的F0代大型蚤内禀增长率分别为0.270和0.249(p<0.01)。F1(1st)代大型蚤内禀增长率有所恢复，在PFOS质量浓度为30 mg/L时，内禀增长率为0.351，显著低于空白组(0.01

暴露于PFOS的F0代大型蚤的内禀增长率随着暴露浓度的增加依次降低，说明较高浓度的PFOS对大型蚤繁殖生长能力影响更大。付保荣等研究表明，随着暴露毒物浓度的增加大型蚤内禀增长率依次降低[18]。这与本研究所得结果一致。

除PFOS暴露质量浓度20 mg/L外，F1(1st)代大型蚤内禀增长率随着暴露浓度的增加依次降低，范围为0.320～0.360(降幅为3.7%～15.4%)，说明较高浓度PFOS可能由母代富集在体内并转移到了F1(1st)代体中，使其恢复起来比较缓慢，进而影响了水蚤种群的发展。

21天毒性实验及其子代恢复情况的研究结果，说明自然界中存在亚致死浓度的PFOS对大型蚤种群的发展足以构成威胁。

3 结 语

PFOS对F0代大型蚤的生长和繁殖有比较严重的影响。当PFOS质量浓度高于20 mg/L时，F0代总产卵量、终点体长和内禀增长率都受到显著抑制，并且随着PFOS暴露浓度的增加，该毒性效应趋于严重，PFOS暴露浓度与大型蚤毒性之间具备明显的剂量-效应关系。相对于F0代大型蚤，Fl(lst)代和F1(3rd)代在没有PFOS的影响下，各项生长和发育指标都有所恢复。当PFOS暴露质量浓度高于30 mg/L时，Fl(lst)代总产卵量和终点体长受到显著抑制。暴露质量浓度小于40 mg/L时，其他各项指标与空白组没有显著差异。F1(3rd)代比Fl(lst)代大型蚤恢复程度更好，除最高浓度组的总产卵量、终点体长和内禀增长率仍受显著抑制，其他指标都接近空白组。

大型蚤总产卵量、终点体长和内禀增长率作为最敏感的指标，在以后的研究中，建议将其用于评价PFOS的慢性毒性。高浓度PFOS可由母代富集在体内并转移到子代中，进而影响水蚤种群的发展。因此，自然界中存在亚致死浓度的PFOS对大型蚤种群甚至整个水生生态系统的发展足以构成威胁，进一步研究PFOS在水中的迁移转化规律，并制定严格的安全排放浓度，对维系水体质量和水生生物安全具有重要的意义。

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Research on chronic toxicity of perfluorooctane sulfonate toDaphniamagna

SHEN Hongyan1,2, YANG Jiepin1，2, CAO Zhihui1, WANG Bing1, ZHAO Yue1

(1.School of Environmental Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang Hebei 050018, China; 2.Hebei Province Key Laboratory of Medical Molecular Chemistry, Shijiazhuang Hebei 050018, China)

Though an experiment of exposingDaphniamagnaand recovering its offspring for both 21 days, the chronic toxicity of perfluorooctane sulfonate (PFOS) toDaphniamagna and its first and third broods F1(1st) and F1(3rd) were investigated. Results show that when the mass concentration of PFOS is higher than 20 mg/L, the number of offspring, length and innate increase rate are significantly inhibited. Compared with the control group, the reduction of the three indicators under the highest exposure concentration are 62.2%, 40.6%, 34.0%(p<0.01), respectively. The toxic effect becomes more serious with gradually increasing of exposure concentration, which shows an obvious dose-response relationship between PFOS concentration of exposure and the toxicity toDaphniamagna. The number of offspring and length of the F1(1st) generation are significantly inhibited when PFOS mass concentration is higher than 30 mg/L. The F1(3rd) generation's recovery extent is better than that of the F1(3rd) generation, and all the indicators recover closely to those of the control group except that the number of offspring, length and innate rate of increase are significantly inhibited when theDaphniamagnais exposed to the PFOS of 50 mg/L. As the most sensitive indicator, the number of offspring, length and innate rate of increase ofDaphniamagnaare suggested for evaluation of PFOS chronic toxicity.

perfluorooctane sulfonate;Daphniamagna; recovery experiments; chronic toxicity

2014-04-01；

2014-05-18；责任编辑：王海云

河北省自然科学基金(B2014208068)；河北省药用分子化学实验室开放基金；河北省环保厅公益课题；河北省重点学科建设基金

沈洪艳(1971-)，女，天津人，教授，博士，主要从事污染物环境行为及效应方面的研究。

1008-1542(2014)04-0354-07

10.7535/hbkd.2014yx04008

TQ453;X52

A

沈洪艳，杨杰频，曹志会，等.全氟辛烷磺酸对大型蚤的慢性毒性研究[J].河北科技大学学报,2014,35(4):354-360.

SHEN Hongyan, YANG Jiepin, CAO Zhihui, et al.Research on chronic toxicity of perfluorooctane sulfonate toDaphniamagna[J].Journal of Hebei University of Science and Technology,2014,35(4):354-360.