水－有机混合介质中电流型生物传感器对葡萄糖的响应

任聚杰，籍雪平，李献锐，王贝贝，王 娜

（1.河北科技大学理学院，河北石家庄 050018；2.河北医科大学基础医学院，河北石家庄 050017）

水－有机混合介质中电流型生物传感器对葡萄糖的响应

任聚杰1，籍雪平2，李献锐2，王贝贝2，王 娜2

（1.河北科技大学理学院，河北石家庄 050018；2.河北医科大学基础医学院，河北石家庄 050017）

利用自组装单分子层（SAMs）／普鲁士蓝（PB）／壳聚糖（Chit）界面固定葡萄糖氧化酶（GOD），构建酶生物传感器，对传感器在极性非质子有机溶剂如乙腈（AN）、二甲基亚砜（DMSO）和N，N-二甲基甲酰胺 （DMF）存在条件下的电化学特性进行了研究，考察了有机溶剂体积分数对传感器响应的影响。结果表明，传感器在50% （体积分数）AN中的电流响应可达到磷酸缓冲溶液（PBS）中的73%。传感器响应速度快、重现性好、抗干扰能力强，展现了高的灵敏度（57.3 mA·M·cm－2）。该传感器用于血清标本中葡萄糖的检测，测定结果与市售葡萄糖酶光度测定试剂盒测定结果相吻合。

生物传感器；葡萄糖氧化酶；水-有机混合介质；血清；葡萄糖

人们一直认为酶只能在水介质中才能维持其活性，很少考虑介质作为一个对其活性的影响因素。后来发现酶在一定条件下的有机相中也具有催化活性，这一发现大大促进了酶的理论和应用研究［1］。在研究介质对酶催化的影响时，常把介质分为无水有机介质、微水系统和水－有机溶剂混合介质等［2］，一般都可叫做非水介质。近20年里，人们对酶在非水介质中的研究和相关应用取得了一些显著进展。2001年，KLIBANOV在《Nature》上发表了“把酶用于有机溶剂以改善酶的性能”的文章，综述了酶在非水介质中的研究及应用［3］。已有的研究结果认为，酶分子中的非共价结合力（如氢键、疏水性和范德华力）对于酶保持其活性结构起着重要的作用，酶表面的水分子对于维持这种相互作用又起着关键的作用。

酶在分析领域的一个重要应用是用来构筑酶电化学生物传感器，酶在非水介质中的应用使得构筑可用于非水介质的酶电化学生物传感器（以下简称非水介质酶传感器）成为可能，同时日益增长的需要（如测定食品、化妆品、药物中难溶于水的成分等）也促进了非水介质酶传感器的发展［4］。

酶电化学传感器是将酶以某种方式固定在电极表面而形成。为获得性能优良的传感器，不仅要求电极表面的活性质点与电极间有良好的电子交换，而且要求电极表面的酶要具有高的活性和稳定性。酶的固定方法和介质的性质都将影响电极表面酶的微环境，从而影响酶的活性，进而影响传感器的响应性能。因此，对不同的酶固定方法及介质性质对非水介质酶传感器性能的影响进行研究，不仅为研制高性能的传感器打下基础，也将为理解酶在非水介质中的催化机理提供有力的帮助。

在非水介质中研究较多的酶传感器有以酪氨酸酶［5－6］、辣根过氧化物酶［4，7］、过氧化氢酶［8］和胆固醇氧化酶［9－10］为基础的传感器。然而，只有少数研究是基于葡萄糖氧化酶（GOD）的传感器［11－12］。其中，GRASSINO等构筑了一种“GOD／Ru-FeNi（CN）6／石墨”传感器，并研究了其在有机溶剂含量为0～60% （体积分数）的水溶液中的响应特性，以及在牛奶、果汁等生物样品中的应用［12］。

极性有机溶剂可与水在一定浓度范围内互溶，有些酶电极在含有少量水的极性溶剂中就表现出高响应性［13－14］，而另一些酶电极则要在含有大量水的极性溶剂中才对底物产生响应［15－16］。最近，研究人员研制了一种可用于水介质中的高灵敏葡萄糖传感器，该传感器是基于电沉积在自组装单分子层 （SAMs）上的可控普鲁士蓝 （PB）和壳聚糖（Chit）构成的［17］。在中性介质中，PB展现了对H2O2还原的高度稳定性和优异的电催化活性。在此基础上，笔者将探索该葡萄糖传感器在水－极性有机溶剂混合介质中的电化学特性，研究介质的性质如疏水性、介电常数（ε）和黏度（η）等对传感器电化学行为的影响规律。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

CHI750电化学工作站，上海辰华仪器公司提供；KQ2200DE超声波清洗器，昆明超声仪器有限公司提供；79HW-1恒温加热磁力搅拌器，江苏荣华仪器制造有限公司提供；DV215CD精密电子天平，OHAUS公司提供。

乙腈（AN）、二甲基亚砜（DMSO）和N，N-二甲基甲酰胺（DMF），均为分析纯，天津永大化学试剂有限公司提供；高氯酸四乙基铵（TEAP），分析纯，TCI化工发展有限公司提供；壳聚糖（Chit），脱乙酰度为75%～85%，浙江玉环化学试剂公司提供；葡萄糖氧化酶（GOD），10 000 U／mg，Sigma公司提供；葡萄糖，分析纯，中国天津凯通化学试剂厂提供；铁氰化钾，分析纯，上海化学试剂厂提供；0.1 mol／L磷酸盐缓冲溶液（PBS），由K2HPO4－KH2PO4配制；其他试剂均为分析纯，实验用水均为高纯水。

1.2 电化学测量

采用三电极系统检测：工作电极为修饰电极，参比电极为Ag／AgCl（3 mol／L KCl），对电极为铂丝。在室温下，以1 mmol／L的 K3［Fe（CN）6］／K2［Fe（CN）6］（含0.1 mol／L PBS）为氧化还原探针，采用循环伏安法（CV）对电极表面进行表征。电位扫描速率为20 m V／s，电位扫描范围为－0.15～0.5 V（vs.Ag／AgCl（3 mol／L KCl））。此外，采用电流－时间曲线研究传感器对葡萄糖电流响应，应用电势为0.0 V。电解质溶液为PBS与有机溶剂的混合物，其中有机溶剂含有30 mmol／L TEAP，以增加溶液导电性。

1.3 酶电极制备

将直径为2 mm的金电极依次用粒径为1.0，0.3，0.05μm的Al2O3粉抛光成镜面，电极每次用蒸馏水超声清洗。然后把电极依次置于丙酮、Piranha溶液（V（H2SO4）∶V（H2O2）＝3∶1）中超声。用水清洗后晾干。然后按照文献［17］报道方法对金电极进行修饰。首先将电极浸入10 mmol／L硫辛酸胺的无水乙醇溶液，在4℃保持15 h，修饰硫辛酸胺单分子自组装层（SAMs），取出后依次用无水乙醇、蒸馏水冲洗。然后将电极置于0.050 mol／L K3［Fe（CN）6］＋0.050 mol／L Fe2（SO4）3＋0.10 mol／L K2SO4＋0.050 mol／L H2SO4溶液中，在－0.05～＋0.5 V电势范围内连续扫描，电沉积普鲁士蓝（PB）。将电极清洗后，在其表面滴加5μL质量浓度为10 mg／m L的GOD溶液，置于4℃冰箱中。干燥后，于电极表面滴加5μL体积分数为1%的Chit，用0.25%（体积分数）戊二醛交联30 min。修饰电极记为Chit／GOD／PB／SAMs／Au。

2 结果与讨论

2.1 修饰电极的电化学表征

电化学阻抗谱（EIS）和 CV 是探测修饰电极表面性能的有效工具。实验中以［Fe（CN）6］3－／［Fe（CN）6］4－为探针，采用CV对金电极表面的组装过程进行监测。

修饰电极在1 mmol／L［Fe（CN）6］3－／［Fe（CN）6］4－溶液（0.1 mol／L PBS，p H 值为7.0）中的循环伏安曲线如图1所示。裸金电极显示了很好的法拉第响应（见图1 A中的a曲线），这是氧化还原过程的扩散控制特性。相反，在SAMs修饰的电极上几乎观察不到电流响应（见图1 B中的b曲线），表明SAMs对氧化还原探针有很好的屏障作用。当PB电沉积到电极表面后，电流响应明显增加（见图1 B中的c曲线），表明PB层在电极与氧化还原探针之间形成了电子转移通道，促进了电子转移。这是由于PB的良好电子媒介作用所致，使电子转移更容易。当GOD组装到电极后，电流响应又降低（见图1 B中的d曲线）。这是GOD的非导电性所致。随着Chit的进一步组装（见图1 B中的e曲线），电流响应又有所增加，说明与GOD相比，Chit促进了电子转移。上述CV结果和EIS实验的结果［17］均表明SAMs，PB GOD和Chit成功组装到金电极上。

图1 裸 金电极，SAMs／Au 电 极，PB／SAMs／Au 电 极，GOD／PB／SAMs／Au，Chit／GOD／PB／SAMs／Au电极在1 mmol／L［Fe（CN）6］3－／［Fe（CN）6］4－ 溶液中的循环伏安曲线Fig.1 Cyclic voltammograms of bare Au electrode，SAMs／Au electrode，PB／SAMs／Au electrode，GOD／PB／SAMs／Au electrode and Chit／GOD／PB／SAMs／Au electrode in 1 mmol／L ［Fe（CN）6］3－／［Fe（CN）6］4－

2.2 有机溶剂对酶传感器的影响

实验选择了极性非质子溶剂AN（ε＝35.9），DMSO（ε＝46.5）和DMF（ε＝36.7）与PBS的混合介质，考察了有机溶剂体积分数对酶电极响应信号的影响。有机溶剂的体积分数从10%增加到60%时，传感器的响应信号随有机溶剂含量的变化如图2所示。

由图2可知，随着有机溶剂含量的增加响应电流逐渐降低，但3种溶剂对电极响应信号影响有所不同。在含AN的PBS溶液中，随AN含量的增加响应电流先快速下降，然后缓慢降低。在50%（体积分数，下同）的AN溶液中，响应信号可以达到在纯PBS中的73%。当AN体积分数超过50%时，响应电流明显降低。在含DMF和DMSO的PBS溶液中，响应电流先缓慢降低，当有机溶剂超过30% 时，响应电流明显下降。在30%DMF和30%DMSO溶液中的响应信号分别达到在纯PBS中的59%和57%。

传感器在混合介质中的电流响应比在PBS中低，这一事实可从以下几个方面解释。首先，有机溶剂的介电常数比水低，会使GOD的离子化程度降低，从而使其活性下降。其次，AN，DMF和DMSO都是非质子溶剂，会对蛋白质分子中的氢键产生影响，从而导致GOD结构的转换。因此，随着有机溶剂含量的增加，会导致酶活性逐渐降低，但传感器在水－有机溶剂混合介质中响应的灵敏度足以满足葡萄糖检测要求。

2.3 电活性物质的干扰

在30%（体积分数，下同）DMSO溶液中加入葡萄糖和不同电活性干扰物，传感器的响应信号见图3。结果显示，与0.50 mmol／L葡萄糖产生的信号相比，0.50 mmol／L尿酸（UA）、1.0 mmol／L对乙酰氨基酚（AP）和0.10 mmol／L抗坏血酸（AA）产生的电流很小。表明UA，AP和AA对传感器响应的影响可以忽略不计。这与在PBS中的结果相一致［17］。AP和UA在50%AN和30%DMF中对传感器的响应（未显示在图中）与30%DMSO中情况类似，而0.10 mmol／L AA的响应信号明显，但当其浓度降到0.02 mmol／L时，电流响应可以忽略不计。传感器表现出了很好的抗干扰能力，这主要归功于壳聚糖交联膜的良好选择渗透性。壳聚糖交联膜可以减少或抑制电活性物质的通透，同时让葡萄糖的氧化产物 H2O2自由通过［17］。结果表明，不仅在PBS而且在有机溶剂存在下，壳聚糖膜均展现了优良的抗干扰能力。

图2 传感器的电流响应与有机溶剂含量之间的关系曲线Fig.2 Relation between the peak currents of the biosensor and the organic solvent contents

2.4 酶传感器对葡萄糖的响应

考察了酶传感器在PBS与有机溶剂的混合溶液中的电流响应行为。酶电极在50%AN，30%DMF和30%DMSO溶液中对葡萄糖的电流响应见图4。

当向含有50%AN的PBS中加入葡萄糖时，在10 s之内传感器的响应达到最大稳态电流的95%，接近在PBS中的响应速度［17］（见图4中的a曲线）。传感器在30%DMF和30%DMSO中的响应速度比在50%AN中慢，20 s内才能达到最大稳态电流的95%（分别见图4中的b曲线和c曲线）。这主要归结于底物的扩散速度。底物的扩散速度是影响传感器电流响应快慢的一个重要因素。由于溶剂黏度差别（20℃时，水：1.00×103Pa·s；AN：0.37×103Pa·s；DMF：0.92×103Pa·s；DMSO：2.24×103Pa·s），葡萄糖在水，AN，DMF和DMSO中的扩散速度不同。另外，有机溶剂与水混合比例不同时的黏度也不同。一般随着有机溶剂含量的增加黏度下降，纯有机溶剂黏度最小。在AN－水体系中，黏度随二者比例改变而改变［18］。50%AN的黏度为0.82×103Pa·s（25℃），接近于水的黏度（0.89×103Pa·s，25℃）。因此传感器在50%AN中的响应速度接近于水溶液中的响应速度。而30%DMF的黏度比水大［19］，因此，电流响应比在水中慢。同理，传感器在30%DMSO中的响应也比在水中慢。然而，传感器在30%DMF和30%DMSO的响应足够满足葡萄糖检测的要求。

传感器对葡萄糖浓度的线性响应曲线见图5。标准曲线的线性范围、回归方程及传感器的灵敏度见表1。在50%AN中，传感器对葡萄糖响应的灵敏度接近在PBS中的灵敏度。

图3 Chit／GOD／PB／SAMs／Au电极对葡萄糖和不同电活性干扰物质的电流响应Fig.3 Current response obtained at the Chit／GOD／PB／SAMs／Au electrode for glucose and different electroactive interferents

图4 Chit／GOD／PB／SAMs／Au电极对葡萄糖响应的电流-时间曲线Fig.4 Current-time curves of the Chit／GOD／PB／SAMs／Au electrode for glucose

图5 电流响应随葡萄糖含量变化的标准曲线Fig.5 Calibration curves of the biosensor as a function of glucose concentration

表1 传感器在不同体积分数有机溶剂中的参数Tab.1 Parameters of the biosensor in different volume percentage of organic solvents

2.5 酶电极的储存稳定性

酶电极的储存环境是影响其重现性的重要因素。储存条件不当会直接影响其寿命和灵敏度。在水－有机溶剂中，如果将使用过的电极直接浸入PBS储存，不可避免地会导致酶的渗漏，影响电极的灵敏度。如果将电极在冰箱干态储存，修饰膜易翘起，甚至从电极表面剥离。经过实验，发现将电极密封于含有PBS的器皿中，且电极表面不直接与PBS接触时储存效果最好。该环境下保存的电极可使酶膜保留适当水分，这不仅维持了酶活性又可避免酶渗漏和酶膜从电极表面剥离。

实验结果表明，电极在该条件下储存2周，电流响应仍能达到80%。电极良好的储存稳定性归功于壳聚糖膜良好的生物兼容性，该膜可为酶提供维持酶活性的微环境。

2.6 血清标本中葡萄糖检测

为了验证电极在实际样品中对葡萄糖的响应，将构建的传感器用于糖尿病人血糖检测。为了获得对所有样品大致相当的电流响应，根据血清中葡萄糖含量的不同，需用血清的体积量为10～40μL。本方法在50%AN中对糖尿病人血糖的检测结果见表2，相对标准偏差（RSD）在10%以内。

本方法测定的结果与标准分光光度酶法进行了比较。2种方法的回归分析所得线性回归方程为y＝0.902x＋0.72，式中y和x分别是采用本方法和标准方法测得的葡萄糖浓度。R2＝0.959，表明2种方法的相关性良好。

表2 糖尿病人血清中葡萄糖测定结果Tab.2 Test result of glucose in serum of diabetic patients

3 结 语

研究了水－有机溶剂混合介质中葡萄糖生物传感器的电化学特性，探讨了有机溶剂体积分数对传感器响应的影响。酶传感器在50%AN中的灵敏度接近在PBS中的灵敏度，展现了对葡萄糖快速、灵敏的响应。该传感器具有良好的储存稳定性，可用于PBS或水－有机溶剂混合介质中血糖的检测。

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Response of amperometric biosensor to glucose in aqueous-organic mixed media

REN Ju-jie1，JI Xue-ping2，LI Xian-rui2，WANG Bei-bei2，WANG Na2
（1.College of Sciences，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang Hebei 050018，China；2.Basic Medical College，Hebei Medical University，Shijiazhuang Hebei 050017，China）

A biosensor was fabricated with glucose oxidase（GOD）immobilized on self-assembled monolayers（SAMs）／Prussian blue（PB）／chitosan（Chit）.The electrochemical characteristics of the biosensor were studied in the presence of dipolar aprotic organic solvents such as acetonitrile（AN），dimethyl sulfoxide（DMSO）andN，N-dimethyl formamide（DMF）.The effect of volume percentage of organic solvents on biosensor response was investigated.It is observed that the response current of the biosensor in 50%AN reaches 73%of that in phosphate buffer solution（PBS）.The amperometric signals are fast，reproducible and exhibiting high sensitivity（57.3 m A·M·cm－2）.The biosensor was used to determine glucose in serum specimens，and the results are consistent with those obtained with the commercially available glucose enzyme photometric kit.

biosensor；glucose oxidase；aqueous-organic mixed media；serum；glucose

O657.1

A

1008-1542（2012）05-0391-06

2012-06-18；

2012-09-05；责任编辑：张士莹

河北省自然科学基金资助项目（B2010000844）

任聚杰（1963-），男，河北石家庄人，教授，博士，主要从事电化学分析方面的研究。

籍雪平教授。E-mail：xpji03＠yahoo.com.cn