门多萨假单胞菌DS04-T对Poly（3HB-co-4HB）的降解研究

李琳琳，高 佳，杨翔华，王战勇

（辽宁石油化工大学环境与生物工程学院，辽宁抚顺 113001）

门多萨假单胞菌DS04-T对Poly（3HB-co-4HB）的降解研究

李琳琳，高 佳，杨翔华，王战勇

（辽宁石油化工大学环境与生物工程学院，辽宁抚顺 113001）

考察了门多萨假单胞菌 DS04-T 对 Poly（3HB-co-4HB）的降解行为。以 Poly（3HB-co-4HB）为唯一碳源，分别考察培养时间、培养温度、摇床转速、装液量、培养基起始p H值、接种量等因素对降解行为的影响。结合正交试验优化获得了菌株的最佳产酶条件：培养时间为28 h，培养温度为30℃，培养基初始p H值为7.3，摇床转速为150 r／min，培养基装液量为120 m L（250 m L三角瓶），接种量为1.5%（体积分数），此条件下菌株对 Poly（3HB-co-4HB）的降解酶活力可达（26.2±0.7）U·m L－1。

门多萨假单胞菌；Poly（3HB-co-4HB）；降解；酶活力

聚羟基脂肪酸酯（PHA，polyhydroxyalkanoates）是近20多年迅速发展起来的生物高分子材料，是很多微生物合成的一种细胞内聚酯，是一种天然的高分子生物材料［1］。由于PHA具有良好的生物降解性和生物相容性，可由微生物发酵生产，已引起材料领域越来越多学者的关注，被认为是环境友好的生物可降解塑料［2－3］。聚（3-羟 基 丁 酸 酯-co-4-羟 基 丁 酸 酯）即 poly（3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate）或 Poly（3HB-co-4HB）］，是PHA的一种。Poly（3HB-co-4HB）是一种典型的半结晶聚合物，它主要由2种共聚物构成，即富3 HB微区Poly（3 HB-co-4 HB）共聚物和富4 HB微区的Poly（3 HB-co-4 HB）共聚物［4］。微生物降解技术成本低廉，是一种具有广泛应用前景的环境治理技术［5－6］。Poly（3HB-co-4HB）作为生物可降解塑料，虽具有良好降解特性，其废弃物能够在环境中实现完全降解，不会造成环境污染。但实际上Poly（3HB-co-4HB）在天然环境中的降解相对缓慢，这就要求在其应用后对其进行必要的降解处理。本研究初步考察了门多萨假单胞菌DS04-T菌株对Poly（3 HB-co-4HB）的降解行为，为其进一步的应用和降解提供相关的基础研究结果。

1 材料与方法

1.1 菌种来源

门多萨假单胞菌（pseudomonasmendocina）DS04-T，笔者实验室保存。

1.2 实验药品及培养基

Poly（3HB-co-4HB）由中国科学院长春应用化学研究所提供；其他药品均为国产分析纯。

基本培养基（质量分数）：NH4Cl（0.1%）；MgSO4·7H2O（0.05%）；CaCl2·2H2O（0.000 5%）；KH2PO4（0.554%）；Na2HPO4·12H2O（1.194%）。

发酵培养基（质量分数）：基础培养基添加Poly（3HB-co-4HB）（0.15%），即为发酵培养基。LB培养基（质量分数）：胰蛋白胨（1.0%）；酵母粉（0.5%）；NaCl（1.0%）。

1.3 实验仪器

ALC-210.4电子天平（德国赛多利斯股份公司提供）；MODEL868型数字式酸度计（美国Thermo公司提供）；HZQ-C空气浴振荡器（哈尔滨东联电子技术开发有限公司提供）；JY 92-Ⅱ超声波细胞破碎机（宁波新芝科器研究所提供）；HH-4型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司提供）；UV-2600紫外可见分光光度计（尤尼克（上海）仪器有限公司提供）；SHP-1500型生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司提供）；BCN-1360B型生物洁净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司提供）；LDZX-50KB立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂提供）；PICO17高速离心机（美国Thermo公司提供）。

1.4 实验方法

将菌种接种于LB液体培养基中，37℃摇床150 r／min培养16 h，将菌液转移至离心管中3 500 r／min离心5 min，倾去上清液，再用基本培养基反复洗涤3次，最后其使悬浮于基本培养基中制成菌悬液，保证菌悬液中细菌浓度约为1×109个／m L。

按发酵培养基配方配制液体培养基，考察不同培养条件对菌株降解Poly（3 HB-co-4 HB）的影响。

1.5 酶活力测定

培养结束后将发酵液以12 000 r／min离心5 min，取上清液（粗酶液），以Poly（3 HB-co-4 HB）乳化液为底物，分光光度法测定Poly（3HB-co-4HB）降解酶活力。取3 m L Poly（3HB-co-4HB）乳化液加1 m L粗酶液，置于50℃恒温水浴中保温30 min后，630 nm测定吸光值变化。以灭活酶液做空白对照。依照酶活单位定义（50℃条件下，每分钟引起光吸收降低0.001（A630 nm）单位所需的酶量定义为1个酶活力单位（U）［7－8］）进行酶活力测定。

2 结果与讨论

2.1 培养时间对菌株的Poly（3HB-co-4HB）降解酶活力的影响

菌悬液以1%（体积分数）接种量接种到100 m L的p H值为7.3的发酵培养基中，37℃，150 r／min摇床振荡培养不同时间。考察培养时间对降解酶活力的影响，如图1所示。

由图1可看出，菌株产酶能力随着培养时间的增加，呈上升趋势。前12 h增加较为缓慢，这应该是菌株的调整和适应阶段；培养时间为12～28 h时酶活力迅速增加，应该是菌株处于对数增长期，菌体迅速增长，状态最佳，产酶能力增加显著；当培养时间大于28 h之后酶活力变化并不明显，这是由于菌株生长进入稳定期的结果。综上所述，初步确定培养时间为28 h。

2.2 培养温度对菌株的Poly（3HB-co-4HB）降解酶活力的影响

菌悬液以1%（体积分数）接种量接种到100 m L的p H值为7.3的发酵培养基中，150 r／min摇床振荡培养28 h。考察培养温度对降解酶活力的影响，如图2所示。

图1 培养时间对菌株的Poly（3 HB-co-4 HB）降解酶活力的影响Fig.1 Effect of cultivation time on Poly（3 HB-co-4 HB）degrading enzyme activity of the strain

图2 培养温度对菌株的Poly（3HB-co-4HB）降解酶活力的影响Fig.2 Effect of cultivation temperature on Poly（3HB-co-4HB）degrading enzyme activity of the strain

由图2可看出，酶活力随培养温度的变化先上升后下降，培养温度为30℃时降解酶活力最高，此后提高温度酶活力呈现下降趋势，一般来说温度对酶活力的影响具有两面性，一方面温度的升高有利于酶活力的提高，另一方面温度过高又会导致酶活力的丧失，综合考虑确定30℃为最适培养温度。

2.3 摇床转对速菌株的Poly（3HB-co-4HB）降解酶活力的影响

菌悬液以1%（体积分数）接种量接种到100 m L的p H值为7.3的发酵培养基中，30℃摇床振荡培养28 h。考察摇床转速对降解酶活力的影响，如图3所示。

由图3可看出，实验范围内，摇床转速对菌株产酶能力的影响并不明显。因摇床转速某种程度上是培养基溶解氧的体现，因此可推测实验范围内摇床转速对培养基溶解氧影响不大，进而对菌株生长和降解能力影响不明显。

2.4 装液量对菌株的Poly（3HB-co-4HB）降解酶活力的影响

菌悬液以1%（体积分数）接种量接种到p H值为7.3的发酵培养基中，30℃，150 r／min摇床振荡培养28 h。考察250 m L三角瓶中的培养基装液量对降解酶活力的影响，结果如图4所示。

图3 摇床转速对菌株的Poly（3 HB-co-4 HB）降解酶活力的影响Fig.3 Effect of shaking revolution on Poly（3HB-co-4HB）degrading enzyme activity

图4 装液量对菌株的Poly（3 HB-co-4 HB）降解酶活力的影响Fig.4 Effect of liquid medium volume on Poly（3HB-co-4HB）degrading enzyme activity

由图4可看出，装液量对酶活力有影响，在实验范围内呈现先上升后下降趋势，装液量也是培养基溶解氧的体现，由图4可见培养基装液量对溶解氧影响比较明显，综合考虑选定培养基装液量为120 m L。

2.5 培养基初始p H值对菌株的Poly（3HB-co-4HB）降解酶活力的影响

菌悬液以1%（体积分数）接种量接种到120 m L的不同p H值的发酵培养基中，30℃，150 r／min摇床振荡培养28 h。考察培养基初始p H值对降解酶活力的影响，结果如图5所示。

由图5可看出，酶活力随培养基初始p H值的增加先上升后下降，p H值为7.3时酶活力最高，其原因在于p H值影响微生物的代谢以及酶活力，过高或过低都不利于微生物的生长代谢，而且也会影响到降解酶的活力，因此确定培养基初始p H值为7.3。

2.6 接种量对菌株的Poly（3HB-co-4HB）降解酶活力的影响

菌悬液以不同接种量接种到p H值为7.3的120 m L发酵培养基中，30℃，150 r／min摇床振荡培养28 h。考察接种量对降解酶活力的影响，结果如图6所示。

图5 培养基初始p H值对菌株的Poly（3HB-co-4HB）降解酶活力的影响Fig.5 Effect of initial p H on Poly（3HB-co-4HB）degrading enzyme activity

由图6可看出，试验范围内接种量对酶活力的影响并不明显，但接种量为1.5%（体积分数）时酶活力相对较高。

2.7 正交试验

结合单因素实验，设计4因素3水平的正交试验优化发酵条件。实验的因素和水平如表1所示。

图6 接种量对菌株的Poly（3HB-co-4HB）降解酶活力的影响Fig.6 Effect of inoculation content on Poly（3 HB-co-4 HB）degrading enzyme activity

表1 因素与水平Tab.1 Factors and the levels

表2 正交试验直观分析Tab.2 Direct analysis of orthogonal test

正交试验的直观分析如表2所示。K n表示以n水平试验的结果的均值。R表示因素极差，即K1，K2，K3中最大值与最小值之差。 从以上实验结果可确定最优培养条件为A1B2C2D2，即培养时间为28 h，初始p H值为7.3，装液量为120 m L，接种量为1.5%（体积分数）。根据表中极差值大小，排列出影响试验的因素的主次顺序：C（装液量）＞D（接种量）＞B（初始p H值）＞A（培养时间）。

正交试验的方差分析如表3所示。

通过表3的方差分析再次证明，装液量对结果影响最大，其他影响因素与之相比影响较小。

综上所述，确定了门多萨假单胞菌DS04-T菌株对Poly（3 HB-co-4 HB）的最佳产酶条件：培养温度为30℃，培养时间为28 h，培养基初始p H值为7.3，摇床转速为150 r／min，培养基装液量为120 m L（250 m L三角瓶），接种量为1.5%（体积分数）。在此优化条件下菌株产生的Poly（3HB-co-4HB）降解酶活力可达（26.2±0.7）U·m L－1。

表3 正交试验方差分析Tab.3 Variance analysis of orthogonal test

［1］PAPANEOPHYTOU C P，VELALI E E，PANTAZAKI A A.Purification and characterization of an extracellular medium-chain length polyhydroxyalkanoate depolymerase from Thermus thermophilus HB8［J］.Polym Degrad and Stabil，2011，96（4）：670-671.

［2］LUCAS N，BIENAIME C，BELLOY C，et al.Polymer biodegradation：Mechanisms and estimation techniques［J］.Chemosphere，2008，73（4）：429-442.

［3］WEN Xing，LU Xiu-ping.Microbial degradation of poly（3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate）in soil［J］.J Polym Environ，2012，20（2）：381-387.

［4］CHANPRATEEP S.Current trends in biodegradable poly-hydroxyalkanoates［J］.J Biosci Bioeng，2010，110（6）：621-632.

［5］刘宝友，罗湘南，邢质贤，等.微生物降解含煤油废水的研究［J］.河北科技大学学报（Journal of Hebei University of Science and Technology），2007，28（4）：314-316.

［6］王瑜瑜，张春晓，郭建博，等.耐盐基因工程菌降解偶氮染料特性研究［J］.河北科技大学学报（Journal of Hebei University of Science and Technology），2010，31（5）：483-486.

［7］WANG Zhan-yong，GAO Jia，LI Lin-lin，et al.Purification and characterization of an extracellular poly（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate）depalymerase fromAcidouoraxsp.HB01［J］.World J Mierob Biot，2012，28（6）：2 395-2 402.

［8］刘天识.可控降解PHB为单体及其发酵条件的探索研究［D］.长春：东北师范大学，2007.

Degradation of Poly（3HB-co-4HB）bypseudomonasmendocinaDS04-T

LI Lin-lin，GAO Jia，YANG Xiang-hua，WANG Zhan-yong
（School of Environmental and Biological Engineering，Liaoning Shihua University，Fushun Liaoning 113001，China）

The degradation of Poly（3HB-co-4HB）bypseudomonasmendocinaDS04-T was studied.Poly（3HB-co-4HB）was used as the sole carbon source of culture medium.The influence of cultivation time，cultivation temperature，shaking revolution，liquid medium volume，initial p H and inoculation content were studied.Combining single factor test and orthogonal test，the optimal degrading enzyme production conditions were chosen as follows：cultivation time is 28 h，cultivation temperature is 30℃，shaking revolution is 150 r／min，initial p H is 7.3，culture medium volume is 120 m L and inoculation content is 1.5%（V／V）.Under the optimized condition，the degradation enzyme activity reaches（26.2±0.7）U·mL－1.

pseudomonasmendocina；Poly（3HB-co-4HB）；degradation；enzyme activity

Q93

A

1008-1542（2012）05-0459-05

2012-03-05；

2012-06-11；责任编辑：王海云

国家自然科学基金资助项目（31100099）；辽宁省教育厅科学技术项目（L2011060）；辽宁石油化工大学科学基金项目（2011XJJ-025）

李琳琳（1988-），女，山东济南人，硕士研究生，主要从事生物化工方面的研究。

王战勇。E-mail：wangzy125＠gmail.com