玉米自交系许178背景的综3染色体单片段代换系的构建

时间：2024-08-31

毛克举，李卫华，付志远，丁冬，汤继华

(河南农业大学农学院，河南郑州450002)

明确农作物重要农艺性状的遗传机制对选育高产、优质、抗病的新品种具有重要的理论意义.然而，由于农作物的产量和重要农艺性状多数表现为典型的数量性状，因此，构建不同的分离群体通过QTL定位的方法对其遗传机制进行分析成为数量性状研究的基础.玉米等作物常用的分离群体主要有 F2，BC1，RIL，DH，IF2等初级作图群体.在利用这些群体对数量性状进行遗传研究过程中，由于数量性状自身表现的复杂性，QTL定位往往难以取得令人满意的结果［1］.染色体单片段代换系(single segment substitution line，SSSL)概念的提出及大量群体的构建为数量性状的研究开辟了一个新的途径［2～4］.染色体单片段代换系在受体的遗传背景上只有一个染色体片段被相应供体的染色体片段所代替，具有片段单一、背景一致、遗传稳定等特点，可以在群体水平上把复杂性状的多基因系统分解为简单的孟德尔遗传因子，为数量性状基因的鉴定、精细定位、克隆以及应用提供保障［3］.在SSSL群体利用中，ESHED等率先以栽培番茄Lycopersicon esculentum为遗传背景的50个野生绿果番茄Lycopersicon pennelliide单片段导入系为试验材料，检测出23个番茄可溶性固含物QTL和18个番茄果实体积 QTL［4］.SSSLs群体已经在番茄、水稻、小麦、玉米、小白鼠等动植物的遗传中发挥了重要作用，显示了其在数量性状遗传研究的独特优势［4～6］.但是与其他作图群体相比，SSSLs的构建需要通过多代的回交同时结合分子标记辅助选择，烦琐费时，限制了染色体单片段代换系的广泛应用.新品种的选育与推广是保证其产量持续提高的一条有效措施，而对玉米产量和重要农艺性状遗传机理进行剖析可以为玉米新品种的选育提供理论依据［7］.在中国玉米育种所利用的骨干自交系中，许178具有综合抗病强、适应性广、对低氮和低磷反应迟钝等突出优点［8］，而自交系综3则具有配合力高等突出优点，但表现出对水分、低氮等逆境条件下敏感的特点，本研究拟以综3为供体亲本、许178为受体亲本，构建一套许178遗传背景的综3单片段代换系库，为鉴定具有特殊性状的单片段代换系提供材料基础.

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用试验材料中国玉米育种中的2个骨干自交系综3和许178，这2个自交系分别是大量推广玉米杂交种豫玉22号和农大108的亲本自交系.

1.2 试验方法

基于IBM 2008 Neighbour整合的SSR分子标记连锁图谱，按照等间距的原则，选择平均分布于10条染色体上700对SSR引物对许178和综3进行多态性标记筛选.所有引物由上海生物工程有限公司合成.

田间试验于2008—2011年在河南农业大学科教园区(郑州)和海南试验基地(海南省乐东县九所镇)进行.2010年在河南农业大学科教园区种植BC3F1群体800行，每行10株，于5叶期按行号混合取样，利用2个亲本之间存在多态性的SSR标记对样品混合DNA进行分析.同时在田间选择与许178表现型存在差异的1 300个单株进行回交，于2010年冬在海南加代自交.2011年将BC4F2材料在河南农业大学科教园区种植成株系，每个株系种5株，用上一代筛选出的差异标记跟踪检测代换片段，每个株系检测1～2株，从中选出含有纯合供体片段的单片段代换系.在BC4F2没有获得纯合单片段的材料，选取含有杂合单片段材料的自交后代，在BC4F3利用分子标记进行筛选，选择纯合的单片段代换系材料.单片段代换系的构建过程如图1所示.

图1 单片段代换系群体的构建过程Fig.1 The construction procedure of the single segment substitution line

1.3 供体染色体片段长度的计算方法

参照YOUNG等［9］的方法计算代换片段长度.不考虑2个相邻标记区间发生的双交换事件，当染色体上相邻标记的基因型相同时，则认为这2个标记之间的区段由相同的标记基因型组成.当染色体上相邻标记的基因型不同时，就认为这2个标记基因型分别组成这个区间的一半.按照微卫星标记连锁图IBM Neighbour 2008上标记间的距离计算供体片段的长度 (www.maizegdb.org).

2 结果与分析

2.1 供体亲本与受体亲本之间的标记多态性

基于IBM 2008 Neighbour整合的SSR分子标记连锁图谱，按照等间距的原则，选用玉米基因组中的700对SSR引物对2个亲本进行多态性筛选，结果发现，有200对SSR引物在亲本间存在多态性，多态率为28.57%(图2).选用其中172对带型明显、易记录的SSR标记用于回交后代的供体片段检测，每条染色体上的SSR标记为12～25，标记之间的平均图距为51.58 cM.

图2 亲本多态性的筛选Fig.2 Screening of parental polymorphism

2.2 单片段代换系群体中的代换片段

经过多代回交、自交结合SSR分子标记检测与选择，剔除不同单片段代换系之间的重复，在BC4F2和BC4F3分离群体中共筛选选到100份纯合的单片段代换系材料(表1).

本研究所获得的100个单片段代换系的代换片段不均匀的分布在玉米10条染色体上，其中代换片段数最多的为第1条染色体，含有22个片段;其次是第2条染色体，含有16个片段;最少的为第5条和第7条染色体，均仅有4个片段.覆盖率最高的是玉米第4条染色体，覆盖率为80.24%;覆盖率最少的为第6条染色体，仅有21.07%(图3).

表1 各染色体上的代换片段及其覆盖率Table 1 Distribution and coverage condition of donor substitution segments

所有代换片段长度为2.25～186.03 cM，总长度为5 314.80 cM，平均长度为 53.15 cM，覆盖玉米基因组的47.85%.其中分布在 2.25 ～50.00 cM的代换片段最多，有55个，占单片段代换系总数的55.00%;代换片段长度分布在 50.0 ～100.00 cM有33个，占33.00%;代换片段长度大于100.00 cM有12个，占12.00%.

3 讨论

SSSL内供体染色体片段的单一性，消除了遗传背景及QTL之间互作的干扰，便于鉴定出功能细小的QTL;利用SSSL与受体表型性状的简单比较，可以把目标性状QTL粗定位于代换片段上;利用不同SSSL之间染色体片段的部分重叠性，可以把数量性状QTL定位到更小的区域内(重叠区或非重叠区内)［2］.基于染色体单片段代换系在生物重要性状遗传研究中所具有的优势，构建某个物种的染色体单片段代换系群体对于基因定位、克隆以及功能分析，和加快分子标记辅助聚合育种的进程具有重要作用［3］.在 SSSLs 群体构建研究中，何风华等［10］用 6个水稻品种为供体，1个优良籼稻品种为受体，用回交和SSR分子标记辅助选择相结合的方法，获得了86 个SSSL，覆盖水稻基因组57.10%.宋建东等［11］以粳稻日本晴为受体和轮回亲本，以广西普通野生稻核心种质DP 15为供体，通过连续回交和SSR标记辅助选择的方法获得了79个SSSL，覆盖水稻全基因组达98.89%.玉米染色体单片段代换系构建方面，袁亮等［12］从BC3F1代开始进行标记跟踪，通过BC3F1，BC4F1，BC4F2和 BC4F3分离群体的标记鉴定，获得了74个以9801为遗传背景的昌7－2染色体单片段代换系.张书红［13］以玉米自交系综3为供体，以87－1为受体亲本，利用137个SSR分子标记，获得84个单片段代换系群体.

染色体单片段代换系的构建效率，与轮回亲本的回交代数、起始检测世代、检测群体的大小、所利用的标记数目等均具有一定的关系.多轮回交的主要目的是重建受体背景［14］，以保持代换染色体不发生变化，回交代数增加将致使导入片段数量减少.统计结果表明，当回交世代高于BC3以后，导入片段数一般少于4个;同时导入片段长度也将逐渐变短，导入片段平均长度平均在20 cM 以下［15］.本研究所获得玉米单片段代换系群体的平均长度为53.15 cM，要大于理论上的平均导入片段长度，出现这种现象的一个主要原因可能与本研究所利用的标记密度不够有关.因此，在以后的研究中应该在不同单片段代换系之间筛选新的差异标记，构建次级单片段代换系群体，以减少单片段代换系群体的供体染色体长度.

图3 100个单片段代换系的染色体位置Fig.3 Chromosomal position of substitution segments of the 100 SSSLs population

此外，在染色体单片段代换系的构建过程中，初始检测群体的大小直接关系到群体构建工作量，为提高构建效率，初始检测群体一般不需要很大，但分子标记数量要多，且要均匀分布在玉米10条染色体上，以便快速准确地确定群体内代换片段的位置、长度和数目，便于后代的跟踪选择.由于多片段中间材料是选育单片段代换系的基础，所以在试验的起始阶段就要注重构建供体代换片段库.本研究从BC3代开始利用分子标记进行供体代换片段检测，由于每个家系内导入片段数理论上一般为4个，在本研究所利用的800个BC3基础家系中供体片段总数将达到3 200个，按每个片段的平均长度20 cM计算，供体片段总长度将超过640 000 cM，是玉米基因组的7倍以上，这些基础材料为构建覆盖玉米全基因组的单片段代换系群体奠定了良好的材料基础.

［1］吴为人，唐定中，李维明.数量性状的遗传剖析和分子剖析［J］.作物学报，2000，26(4):501 －507.

［2］刘冠明，李文涛，曾瑞珍，等.水稻亚种间单片段代换系的建立［J］.中国水稻科学，2003，17(3):201－204.

［3］曾瑞珍，施军琼，黄朝锋，等.籼稻背景的单片段代换系群体的构建［J］.作物学报，2006，32(1):88 －95.

［4］ ESHED Y，ZAMIR D.A genomic library of Lycopersicon pennelliin L.esculentum:a tool for fine mapping of genes［J］.Euphytica，1994，79:175 －179.

［5］王立秋，赵永锋，薛亚东，等.玉米衔接式单片段导入系群体的构建和评价［J］.作物学报，2007，33(4):663－668.

［6］杨武云，胡晓蓉，毛沛.采用桥梁单体培育小麦品种问染色体代换系的新方法［J］.华北农学报，1997，12(4):23－27.

［7］李九云，于翠红，高增玉.玉米种质资源研究与发展趋势探讨［J］.河北农业科学，2009，13(4):58－60.

［8］汤继华，谢惠玲，黄绍敏，等.缺氮条件下玉米自交系叶绿素含量与光合效率的变化［J］.华北农学报，2005，20(5):10 －12.

［9］ YOUNG N D，TANKSLEY S D.Restiction fragment length polymorphism maps and the concept of graphical genotypes［J］.Theor Appl Genet，1989，77:95 － 101.

［10］何风华，席章营，曾瑞珍，等.利用高代回交和分子标记辅助选择建立水稻单片段代换系［J］.遗传学报，2005，32(8):825 －831.

［11］宋建东，黄悦悦，阳海宁，等.粳稻为背景的普通野生稻单片段代换系群体的初步构建［J］.广西农业科学，2010，41(4):297 －302.

［12］袁亮，丁冬，李卫华，等.玉米优良自交系单片段代换系的构建［J］.玉米科学，2011，20(2):52－55.