棉铃虫和烟夜蛾内生殖器官发育和营养物质含量变化的研究

王甜甜，宋鹏飞，程晓东，郭线茹，原国辉，罗梅浩

(河南农业大学植物保护学院，河南 郑州 450002)

棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)和烟夜蛾Helicoverpa assulta(Guenée)均属鳞翅目夜蛾科铃夜蛾属昆虫，其成虫、幼虫形态特征很相似，食性特点、为害症状也较一致，且具有杂交可育性［1］，已有研究证明它们属亲缘相近的2个种［2］.但二者的寄主范围却有很大差异，棉铃虫是典型的多食性昆虫，其食料植物在中国有20 多科200 多种，最喜食锦葵科、茄科和豆科的棉花、烟草、玉米、小麦、大豆、番茄等植物［3］.而烟夜蛾是一种寡食性昆虫，寄主植物只有烟草、辣椒等少数植物［4］.在它们的寄主植物中，只有烟草为二者的共同寄主，也唯独在烟草上二者可以稳定共存［5］.由于这2种昆虫既相近又相远的生物学特性，一直以来人们都在致力于它们之间的差异研究.张礼生［6］研究了二者的核型特征，结果显示，烟夜蛾染色体多态性更为显著，而棉铃虫却相对稳定.王鸿雷等［7］分析了外源不饱和脂肪醇及乙酸酯在棉铃虫和烟夜蛾性信息素腺体中的转化，结果表明，棉铃虫性信息素腺体组织具有较高的乙酸酯酶活性，而烟夜蛾性信息素腺体乙酸酯酶活性很低.付晓伟等［5］研究了二者对低浓度烟草挥发物的触角电位反应，发现与棉铃虫相比，烟夜蛾嗅觉神经系统在其寄主定向行为中所起的作用更重要、也更专化.罗梅浩等［8，9］比较了二者幼虫的生态位和体色差异，表明棉铃虫在烟草上的时间生态位宽度、生态位重叠和竞争系数均大于烟夜蛾;棉铃虫幼虫体色变化复杂于烟夜蛾.许刚等［10］研究了2种昆虫对烟碱的反应，结果是烟碱对棉铃虫没有影响，但对烟夜蛾的取食有刺激作用.XU 等［11］对二者中肠蛋白酶的性质进行比较，发现2种昆虫很相似，无明显差异.程晓东等［12］研究了二者交配和产卵的差异，表明棉铃虫的交配率显著高于烟夜蛾，交配持续时间和产卵前期均短于烟夜蛾，其产卵量显著高于烟夜蛾.为了弄清棉铃虫和烟夜蛾交配和产卵行为存在差异的形态和生理原因，作者研究了不同日龄下2种夜蛾内生殖器官形态和营养物质含量的变化，以期为研究棉铃虫和烟夜蛾的预测预报和防治提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试昆虫 棉铃虫和烟夜蛾均从河南农业大学科教园区烟草上采集，在控光(14 L∶10 D)、控温(27 ±1)℃、控湿(相对湿度65%～85% )的人工气候箱中用人工饲料饲养.待化蛹后，把蛹按雌雄分开;成虫羽化后喂以质量浓度为100 g·L-1的蔗糖水.分别取末日龄蛹和1 日龄、2 日龄、3 日龄未交配和3 日龄交配后的雌、雄成虫为供试昆虫.

1.1.2 试剂与仪器

1.1.2.1 试剂 乙醇∶乙醚;考马斯亮蓝G-250 试剂:称取100 mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50 mL 体积分数95%乙醇中，加入100 mL 体积分数85%磷酸，移入1000 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容;蒽酮试剂:取密度为1.84 g·mL-1的浓硫酸760 mL，加水稀释至1000 mL，再溶入蒽酮2 g，用棕色瓶置暗中保存;磷酸缓冲液(PBS):NaCl 8 g，KCl 0.2 g，KH2PO40.24 g，Na2HPO41.44 g，加ddH2O 定容至1 L，调节pH 值为7.4;牛血清白蛋白标准溶液:称取10 mg 牛血清白蛋白，溶于100 mL 蒸馏水中，质量浓度为100 mg·L-1;葡萄糖标准液:称取100 mg 葡萄糖，放入100 mL 量瓶中，摇匀，吸取此液5.0 mL 放入另1个50 mL 量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，质量浓度为100 mg·L-1葡萄糖;牛血清白蛋白，Sigma 进口分装;葡萄糖及其它试剂均为分析纯.以上试剂均购自郑州通亚化玻设备有限公司.

1.1.2.2 仪器 PGX 智能光照培养箱(宁波莱福科技有限公司);UV-1201 紫外/可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司);TGL-16G-A型台式高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂);MDF-192型超低温冰箱(日本三洋公司);Motic SMZ 168-BL体视显微镜(中国麦克奥迪实业集团有限公司);百分之一电子天平(上海方瑞仪器厂).

1.2 试验方法

1.2.1 雌性内生殖器官解剖分别选取个体大小相同的末日龄蛹和1 日龄、2 日龄、3 日龄未交配成虫，先用乙醚麻醉，再用水漂洗法解剖，每组解剖15 头.具体步骤为:(1)使成虫背向上，用昆虫针固定在蜡盘上，将其翅用昆虫针张开后固定或剪掉，然后往蜡盘中注入清水，浸没虫体.(2)用剪刀从成虫尾部向胸部纵向剖开，形成“T”形开口;然后拉开体壁，并用昆虫针将拉开的体壁在虫体的两侧固定，以露出生殖器官，并尽量处理掉脂肪体.(3)用解剖针挑动中输卵管、侧输卵管、卵巢管和交配囊，去除牵连卵巢的气管、脂肪体等，用镊子将卵巢管连同中输卵管、侧输卵管和交配囊轻轻拉出腹外，将曲折的两组卵巢管拉直(注意不要使卵巢管因拉直而变形)，分两边固定在蜡盘上.(4)用滤纸小心吸去水分，测量中输卵管、侧输卵管和卵巢管的长度;测量交配囊茎的长度、交配囊体的长度和宽度.

1.2.2 雄性内生殖器官解剖 方法同1.2.1.每组解剖15 头成虫.将雄蛾的生殖系统轻轻拉出，将生殖附腺和精巢小心分离开来，用滤纸小心吸去水分，测定精巢的直径.

1.2.3 棉铃虫和烟夜蛾内生殖器官中营养物质含量的测定

1.2.3.1 样品的采集与制备 取2种夜蛾末日龄蛹和1 日龄、2 日龄、3 日龄未交配和3 日龄交配后2 h的雌、雄虫各3 头，3次重复，在磷酸缓冲液中解剖获得雌、雄成虫内生殖器官.用解剖针刺破精巢、输精管、贮精囊使其释放内容物，将内容物混合后作为待测样品.同样方法分别取雄性附腺内容物混合以及雌虫卵巢管、侧输卵管、中输卵管内容物混合，称重后加入双蒸水定容至2 mL，置于-40℃备用.

1.2.3.2 蛋白质含量的测定 采用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量，在试管中分别精确移取牛血清白蛋白标准溶液0 ，0.20 ，0.40 ，0.60 ，0.80，1.00 mL，加蒸馏水至1 mL，然后在各支试管中加5 mL 考马斯亮蓝G-250 溶液，充分振荡混合，室温(25℃)放置5 min后，用UV-1201型分光光度计于595 nm 波长下测其OD 值［13］，以牛血清白蛋白标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y =0.0045X+0.0227(R2=0.9997).取0.1 mL 定容后的各器官内容物于试管中，加5 mL 考马斯亮蓝G-250 溶液，充分振荡混合，室温(25℃)放置5 min后，于595 nm 波长下测其OD 值，然后在标准曲线上求出样品中蛋白质含量，试验设3次重复.

1.2.3.3 可溶性总糖的测定 取l mL 定容后的各器官内容物，加入0.33 mol·L-1的H2SO40.4 mL，混匀，再加入100 g·L-1钨酸钠溶液0.4 mL，摇匀后静置10 min，4℃下在高速冷冻离心机上6000 r·min-1离心10 min 除去沉淀，得无蛋白血清待用［14］.采用蒽酮法［15］测定可溶性总糖，分别取0，0.20 ，0.40 ，0.60 ，0.80 ，1.00 mL 葡萄糖标准液于6 支具塞试管中，以蒸馏水增加至1 mL，再加入5 mL 蒽酮试剂，塞上塞子、摇匀，放入沸水浴10 min，取出冷却至室温后，用UV-1201型分光光度计在620 nm 波长下测定不同浓度葡萄糖溶液的吸光度，制作葡萄糖标准曲线，回归方程为Y =0.0058X-0.0081(R2=0.9995).取1 mL 定容后的上清液于试管中，加入5 mL 蒽酮试剂混匀，放入沸水浴10 min，取出冷却至室温后，在620 nm 波长下检测可溶性总糖的含量，试验设3次重复.

1.2.4 数据的统计分析 数据经SPSS17.0 统计软件进行单因素方差分析，所获数据用平均数±标准误来表示.2种夜蛾的种间差异采用t-检验进行比较.

2 结果与分析

2.1 不同发育阶段棉铃虫和烟夜蛾雌性内生殖器官发育进度比较

不同日龄棉铃虫和烟夜蛾雌性内生殖器官的发育进度见表1.从表1可以看出，随着日龄的增加，棉铃虫和烟夜蛾输卵管、侧输卵管和卵巢管的长度也相应增加.同一发育时期，棉铃虫中输卵管和侧输卵管的长度均显著或极显著大于烟夜蛾;其卵巢管也均长于烟夜蛾，但差异不显著.

棉铃虫和烟夜蛾雌虫交配囊发育比较见表2.从表2可以看出，随着日龄的增加，棉铃虫和烟夜蛾的蛾交配囊茎的长度和交配囊体的长度也相应增加，交配囊体的宽度却有所下降.同一发育时期，棉铃虫交配囊茎的长度和交配囊体的宽度均大于烟夜蛾，但差异不显著;其交配囊体的长度均极显著长于烟夜蛾.

2.2 不同发育阶段棉铃虫和烟夜蛾精巢发育进度比较

从表3可以看出，随着日龄的增加，2种夜蛾精巢的直径却相应降低.棉铃虫和烟夜蛾末日龄蛹精巢直径分别为2178.7，1877.4μm，到3 日龄成虫时分别降至1913.0 ，1477.0μm.同一发育时期棉铃虫的精巢直径均极显著大于烟夜蛾.

2.3 棉铃虫和烟夜蛾内生殖器官中营养物质含量的差异

2.3.1 不同发育时期棉铃虫和烟夜蛾雄性内生殖器官中可溶性总糖和蛋白质含量的变化 由表4可知，棉铃虫和烟夜蛾雄性内生殖器官中可溶性总糖和蛋白质含量均随着日龄的增加而增加，3 日龄未交配雄蛾内生殖器官中可溶性总糖含量较末日龄蛹分别增加了1.40倍和2.04倍;蛋白质含量较末日龄蛹分别增加了1.79倍和2.26倍.交配后，2种夜蛾雄性内生殖器官中可溶性总糖和蛋白质含量均较未交配同日龄雄蛾有所增加.同一发育时期，棉铃虫雄性内生殖器官中可溶性总糖均显著低于烟夜蛾，蛋白质含量却均显著高于烟夜蛾.

表1 棉铃虫和烟夜蛾雌虫输卵管和卵巢管发育比较Table 1 Comparison on the female oviduct and ovariole of H.arm and H.ass

表2 棉铃虫和烟夜蛾雌虫交配囊发育比较Table 2 Comparison on the female bursa copulatrix of H.arm and H.ass

表3 棉铃虫和烟夜蛾雄虫精巢发育比较Table 3 Comparison on the male testes of H.arm and H.ass

由表5可知，2种夜蛾雄性附腺中可溶性总糖和蛋白质含量亦均随日龄的增加而增加.棉铃虫和烟夜蛾3 日龄未交配成虫雄性附腺中可溶性总糖含量较末日龄蛹分别增加了3.47倍和2.80倍.但2种夜蛾3 日龄交配后的成虫雄性附腺中可溶性总糖含量显著降低到10.85 ，8.65 mg·g-1，稍低于末日龄蛹雄性附腺可溶性总糖含量.棉铃虫和烟夜蛾3 日龄未交配成虫蛋白质含量较末日龄蛹分别增加了1.45倍和1.33倍，但2种夜蛾3 日龄交配后的成虫雄性附腺蛋白质含量极显著降低到106.77，91.44 mg·g-1，与末日龄蛹雄性附腺蛋白质含量水平接近.由表5 还可看出，同一发育时期，棉铃虫雄性附腺中蛋白质含量均显著或极显著高于烟夜蛾，可溶性总糖含量除末日龄蛹和3 日龄交配后的成虫外，仍均极显著高于烟夜蛾.

2.3.2 不同发育时期棉铃虫和烟夜蛾雌性内生殖器官中可溶性总糖和蛋白质含量的变化 由表6可以看出，2种夜蛾雌性内生殖器官中可溶性总糖含量在2 日龄前随日龄的增加而降低，3 日龄时又明显上升;蛋白质含量均随日龄的增加而增加.2种夜蛾3 日龄交配后的雌虫可溶性总糖和蛋白质含量均较同日龄未交配雌虫明显增加.棉铃虫和烟夜蛾末日龄雌蛹内生殖器官中可溶性总糖含量分别为11.14 ，20.21 mg·g-1，2 日龄未交配雌虫可溶性总糖含量分别降低至2.41 ，8.89 mg·g-1，3日龄未交配雌虫可溶性总糖含量分别增加到6.09，11.37 mg·g-1，3 日龄交配后的雌虫可溶性总糖含量又分别增加到10.86 ，15.88 mg·g-1.是3 日龄未交配雌虫可溶性总糖的1.78倍和1.40倍.棉铃虫和烟夜蛾末日龄雌蛹内生殖器官中蛋白质含量分别为65.41 ，60.12 mg·g-1，3 日龄未交配成虫蛋白质含量分别增加到94.30 ，81.89 mg·g-1.3 日龄交配后的成虫蛋白质含量又分别增加到135.96 ，112.24 mg·g-1，是3 日龄未交配成虫蛋白质含量的1.44倍和1.37倍.由表6 还可看出，同一发育时期，棉铃虫雌性内生殖器官中可溶性总糖均极显著低于烟夜蛾，但蛋白质含量却均显著或极显著高于烟夜蛾.

表4 棉铃虫和烟夜蛾雄性内生殖器官中可溶性总糖和蛋白质含量的变化Table 4 Content of total carbohydrate and protein of male internal genital organs of H.arm and H.ass mg·g -1

表5 棉铃虫和烟夜蛾雄性附腺中可溶性总糖和蛋白质含量变化Table 5 Content of total carbohydrate and protein of male accessory gland of H.arm and H.ass mg·g -1

表6 棉铃虫和烟夜蛾雌性内生殖器官中可溶性总糖和蛋白质含量变化Table 6 Content of total carbohydrate and protein of female internal genital organs of H.arm and H.ass mg·g -1

3 结论与讨论

程晓东等［12］研究表明，不同蛾龄，棉铃虫的产卵量均显著高于烟夜蛾，产卵前期显著短于烟夜蛾.本研究结果显示，同一发育时期，棉铃虫雌性内生殖器官的中输卵管、侧输卵管和卵巢管均长于烟夜蛾;其雄性内生殖器官的精巢直径均显著大于烟夜蛾.可能正是因为棉铃虫的雌性内生殖器官较烟夜蛾发达和发育速度快，致使其产卵量高于烟夜蛾.研究表明，不同蛾龄，棉铃虫的交配率均显著高于烟夜蛾，交配持续时间均显著短于烟夜蛾［12］.本研究结果显示，同一发育时期，棉铃虫雌性内生殖器官的交配囊茎长度和交配囊体宽度均大于烟夜蛾;交配囊体显著长于烟夜蛾，这可能就是棉铃虫交配率高于烟夜蛾、交配持续时间短于烟夜蛾的原因.棉铃虫与烟夜蛾杂交，正交产生可育的雄性F1代，反交产生可育的雌性F1代，这说明2个近缘种夜蛾雌雄生殖器官在形态上虽存在一定差异，但在生殖上仍存在一定的相容性［16］.在自然界中，没有发现这2种昆虫的杂交后代，室内杂交试验表明，即使交配，后代卵孵化率和幼虫成活率均很低［17］.棉铃虫和烟夜蛾内生殖器官发达程度和发育进度上的差别可能也在阻断这两种昆虫基因交流方面起着重要的作用，但还需进一步研究.

本研究测定了2种夜蛾不同发育时期及交配和未交配3 日龄成虫内生殖器官中可溶性总糖和蛋白质含量的差异，结果表明，棉铃虫雌、雄内生殖器官和雄性附腺中蛋白质含量均显著高于烟夜蛾，而且交配时棉铃虫雄性内生殖器官向雌性内生殖器官中转移的营养物质多于烟夜蛾，这或许就是棉铃虫产卵量和卵孵化率高于烟夜蛾的原因.棉铃虫雄性和雌性内生殖器官中可溶性总糖的含量却低于烟夜蛾，这可能是因为棉铃虫的发育速度快于烟夜蛾所致，并且在试验中发现棉铃虫远比烟夜蛾活泼，活动性强消耗了大量的糖类物质，致使其内生殖器官中可溶性总糖的含量低于烟夜蛾.交配后，果蝇雄性附腺蛋白使雌虫产卵量明显增加，接受再交配的能力降低［18］.本研究表明，交配后，棉铃虫和烟夜蛾雄虫内生殖器官中蛋白质含量有所增加，雄性附腺中的蛋白质含量大幅度降低，雌、雄内生殖器官(除雄性附腺外)中的糖含量明显增加，而雄性附腺中的糖含量却明显降低，这与田玲等［19］研究的桑天牛成虫交配后生殖系统可溶性总糖和蛋白质含量的变化结果一致，说明雄性附腺是某些蛋白合成的特异性场所，且合成的蛋白质大部分参与精液的形成传递给雌虫，并在短时间内不能迅速恢复到交配前的含量水平.

在自然条件下，普通烟田烟夜蛾第2 代和第3代幼虫的发生高峰期分别比棉铃虫晚17 d和13 d，黄花烟田分别比棉铃虫晚18 d和15 d［20］.2种害虫的空间生态位相似性比例高达0.8559，但在同一烟草部位的共存比例最高仅有9.30%［21］.烟夜蛾和棉铃虫的生物学和生态学习性非常相似，必然造成在它们在时间和空间上的竞争.本研究结果显示，2种夜蛾生殖器官在发育进度上存在显著差异，这或许就是导致它们在寄主上产生时间生态位分离的原因.烟夜蛾在烟草上的潜在增长率小于棉铃虫，但是它对烟草有较强的利用和转化能力，能有效地将取食的烟草转化为自身营养，从而提高种群的存活率，使上、下代的种群数量接近平衡，接近于“K 对策”类型;棉铃虫对烟草的利用和转化能力较弱，不能有效地将取食的烟草转化为自身营养，致使种群的存活率下降，但棉铃虫能通过增大对烟草的取食量和提高雌成虫的繁殖力来弥补这种不足，使种群有较高的内禀增长率，易于突然暴发，接近于“r 对策”类型［20］.棉铃虫的生殖器官在发育进度上较烟夜蛾快，生殖器官内的营养物质含量也比烟夜蛾高，为棉铃虫保持较高的繁殖力，繁衍种群奠定了基础.

［1］WANG C Z.Interpretation of the biological species concept from interspecific hybridization of two Helicoverpa species［J］.Chinese Science Bulletin，2007，52(2):284-286.

［2］王琛柱.从棉铃虫和烟青虫的种间杂交理解生物学物种概念［J］.科学通报，2006，56(21):2573-2575.

［3］郭予元.棉铃虫的研究［M］.北京:中国农业出版社，1998.

［4］马继盛，罗梅浩，郭线茹，等.中国烟草昆虫［M］.北京:科学出版社，2007.

［5］付晓伟，郭线茹，罗梅浩，等.两近缘种夜蛾对低浓度烟草挥发物的触角电位反应［J］.生态学报，2009，29 (6):2962-2970.

［6］张礼生.棉铃虫与烟青虫细胞遗传性研究［D］.北京:中国农业大学，2004.

［7］王鸿雷，赵成华，闻云花，等.棉铃虫和烟青虫性信息素腺体脂肪醇和乙酸酯转化的比较研究［J］.昆虫学报，2008，51(9):895-901.

［8］罗梅浩，郭线茹，郑晓军，等.烟青虫和棉铃虫在烟草上的生态位及其种间竞争［J］.中国烟草学报，2002，8(4):34-37.

［9］罗梅浩，郭线茹，张宏亮，等.烟田烟青虫和棉铃虫幼虫体色变化及遗传规律初步研究［J］.河南农业大学学报，1999，33(3):263-266.

［10］许 刚，钦俊德.实夜蛾属二近缘种对寄主植物次生物质的反应:次生物质对幼虫生长和食物利用的影响［J］.昆虫学报，1987，30(4):359-366.

［11］XU G，QIN J D.Extraction characterizationg of midgut protease from Helicoverpa armigera and H.assulta(Lepidoptera Noctuidae)and their inhibition by tannic acid［J］.J Econ Entomol，1994，87(2):334-338.

［12］程晓东，贾月丽，蔡永萍，等.棉铃虫和烟夜蛾生殖行为比较研究［J］.河南农业大学学报，2011，45(3):333-338.

［13］强 伟，王洪伦，周昌范，等.考马斯亮蓝G-250 染色法测定柠锦鸡儿种子中可溶性蛋白含量［J］.氨基酸和生物资源，2011，33(3):74-76.

［14］丁晓帆，林茂松，刘亮山.几种昆虫病原线虫对大蜡螟幼虫血淋巴及其能源物质含量的影响［J］.南京农业大学学报，2005，28(3):43-47.

［15］董爱文，陈阳波，向中，等.蒽酮法测定爬山虎果中糖类的含量［J］.中国野生植物资源，2003，22(1):47-50.

［16］WANNG C Z ，DONG J F.Interspecific hybridization of Helicoverpa armigera and H.assulta(Lepidoptera:Noctuidae)［J］.Chin Sci Bull，2001，46:489-491.

［17］赵新成.棉铃虫和烟青虫的种间杂交及雄蛾对性信息素行为和电生理反应的遗传研究［D］.北京，中国科学院动物研究所，2005.

［18］SWANSON W J.Sex peptide and the sperm effect in Drosophila melanogaster［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2003，100(17):9643-9644.

［19］田 玲，嵇保中，刘曙雯，等.桑天牛成虫交配后血淋巴和生殖系统可溶性总糖和蛋白质含量的变化［J］.昆虫学报，2008，51(1):96-101.

［20］付晓伟.两近缘种铃夜蛾与烟草互作机制的比较研究［D］.郑州:河南农业大学，2009.

［21］罗梅浩，郭线茹，郑晓军，等.烟青虫和棉铃虫在烟草上的生态位及其种间竞争［J］.中国烟草学报，2002，8(4):34-37.