疮痂链霉菌许昌亚种SCY114发酵条件的研究

郑东光，周 蕊，李俊州，余红雨，文才艺

(河南农业大学植物保护学院，河南 郑州 450002)

放线菌是寻找和发现天然生物活性物质的重要微生物资源.目前世界药物市场上67%的抗生素由放线菌产生［1］，因此，从土壤中筛选具有较强拮抗作用的放线菌，并通过其发酵获取活性代谢产物，是开发生物农药的重要途径［2］.目前，将微生物次生代谢物作为生物农药主要活性成分，应用于植物病害治理是植物病害生物防治的主要方式之一［3］.在生物农药生产过程中，微生物发酵的生产水平不仅取决于生产菌种的性能，而且取决于培养基的组成和培养条件，如营养要求、培养温度、对氧的要求等.因此，设计合理的发酵工艺，使生产菌种处于最佳产物合成的环境，可取得最好的发酵效果［4，5］.疮痂链霉菌(Streptomyces scabiei)是引起马铃薯疮痂病的主要病原菌之一.国内外学者对疮痂链霉菌的研究主要集中在致病性分化、毒素及其遗传多样性等方面，近年来，国外已有将其作为生防菌株和生物代谢活性物质来源的研究报道［6］.如YOO 等［7］报道，S.scabiei subsp.chosunensis M0137产生的次生代谢产物能够用来治疗肿瘤和癌症;HAN［8］等报道，S.scabiei Strain PK-A41的次生代谢产物对辣椒疫霉病菌、小麦纹枯病菌等多种病原真菌具有较强的抑制作用.目前，国内尚未见将其作为生防菌株进行研究的相关报道.疮痂链霉菌许昌 亚种SCY114 (S.scabiei subsp.xuchangensis SCY114)是1株对小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis var.tritici)、小麦纹枯病菌(Rhizotonia cerealis)等多种植物病原真菌有较强拮抗作用的生防链霉菌，其活性代谢产物为星形孢菌素(Staurosporine)，具有有效防治小麦全蚀病的生防潜力［9］.本研究对菌株SCY114的培养基和发酵条件进行了初步研究，为该菌株的进一步研究和开发提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 疮痂链霉菌许昌亚种SCY114和小麦全蚀病菌均由河南农业大学植物保护学院植物病害生物防治研究室分离、保存.

1.1.2 培养基 斜面培养基(G-1)和抑菌活性测定培养基(PDA)，按文献［10］的方法制备;种子培养基为黄豆粉20 g，CaCO35 g，葡萄糖20 g，H2O 1000 mL;基础培养基为黄豆饼粉20 g，可溶性淀粉20 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，H2O 1000 mL，pH 值7.2～7.4.

1.2 试验方法

1.2.1 种子液的制备 用接种针将活化的斜面菌种挖块接种于装有125 mL种子培养基的500 mL三角瓶中，于28℃，180 r·min-1条件下培养48 h，备用.

1.2.2 单因素试验 在基础培养基中，培养条件为接种量体积分数5%，种龄48 h，温度28℃，转速180 r·min-1，培养时间5 d.分别进行如下试验:(1)用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖等量替换基础发酵培养基中的可溶性淀粉;(2)用玉米粉、牛肉膏、酵母粉、燕麦粉、蛋白胨等量替换基础发酵培养基中的黄豆饼粉;(3)改变可溶性淀粉的质量浓度，依次为0，10，20，30，40，50 g·L-1;(4)改变黄豆粉饼的质量浓度，依次为0，10，20，30，40、50，60 g·L-1;(5)改变K2HPO4的质量浓度，依次为0，0.25，0.5，0.75，10 g·L-1;(6)改变MgSO4·7H2O的质量浓度，依次为0，0.25，0.5，0.75，10 g·L-1.

1.2.3 培养基优化 根据单因素试验结果，选择培养基中可溶性淀粉、黄豆粉饼、MgSO4·7H2O、K2HPO44个因素，分别取3个水平，并以L9(43)正交表进行正交试验［11，12］，试验设计见表1.

表1 培养基配方正交试验因素和水平Table 1 Orthogonality test of medium formula g·L -1

1.2.4 发酵条件的研究 采用优化培养基，在其他培养条件相同时，分别进行如下试验:(1)调节发酵培养基的初始pH 值，分别为4，5，6，7，8，9和10;(2)发酵温度分别为25，28，30和32℃;(3)摇床转速分别为160，180，200，220 r·min-1;(4)培养装液量分别为每个250 mL 三角瓶中装入60，70，80，90和100 mL;(5)培养时间分别为24，36，48，60和72 h;(6)接种量分别为体积分数2%，4%，6%，8%，10%和12%.(7)培养时间分别为1，2，3，4，5，6，7，8，9和10 d.发酵完毕后，收集发酵液，测定发酵液的抑菌活性.

1.2.5 发酵液活性测定发酵液经1000 r·min-1离心15 min后过滤，收集各处理的发酵滤液，以小麦全蚀病菌为靶标，利用含毒介质法［13］测定发酵液的抑菌活性，每个处理重复3次.

2 结果与分析

2.2 培养基单因素试验结果

2.2.1 不同碳源对菌株SCY114发酵效果的影响

结果表明，菌株SCY114 在以蔗糖和麦芽糖作为唯一碳源的条件下，发酵效果较差，而在葡萄糖、可溶性淀粉和乳糖分别作为唯一碳源时，发酵效果较好(图1).抗生素合成能力从大到小依次为淀粉＞葡萄糖＞乳糖＞蔗糖＞麦芽糖.考虑到实际生产中淀粉成本低廉，并且由于可溶性淀粉为可缓慢利用的碳源，有利于延长代谢产物的合成，特别有利于延长抗生素的分泌期，因此选择其作为菌株发酵的碳源.

图1 不同碳源对抗生素产量的影响Fig.1 Effect of different carbon sources on antibiotic yield

2.2.2 不同氮源对菌株SCY114发酵效果的影响

在供试的6种氮源中，菌株SCY114 能有效利用玉米粉、黄豆饼粉和燕麦粉，其中以黄豆饼粉和燕麦粉的发酵效果最佳(图2).考虑到来源和成本问题，本试验选择黄豆饼粉作为发酵培养基的氮源.

图2 不同氮源对抗生素产量的影响Fig.2 Effect of different nitrogen sources on antibiotic yield

2.2.3 不同质量浓度可溶性淀粉对菌株SCY114发酵效果的影响 从试验结果可以看出，当培养基中可溶性淀粉质量浓度为10 g·L-1时，发酵效果最好;当可溶性淀粉大于10 g·L-1时，发酵效果逐渐降低(图3).说明在不考虑其他因素影响的前提下，过多的碳源不利于菌株次级代谢产物的积累.

图3 不同质量浓度可溶性淀粉对抗生素产量的影响Fig.3 Effect of different soluble starch contents on antibiotic yield

2.2.4 不同质量浓度黄豆饼粉对菌株SCY114发酵效果的影响 从试验结果可以看出，随着黄豆饼粉质量浓度的增加，发酵效果逐渐提高，当黄豆饼粉的质量浓度为50 g·L-1时，发酵效果最佳(图4).

图4 不同质量浓度黄豆饼粉对抗生素产量的影响Fig.4 Effect of different soybean meal contents on antibiotic yield

2.2.5 不同质量浓度K2HPO4对菌株SCY114发酵效果的影响 试验结果表明，随着K2HPO4的含量增加，菌株SCY114发酵效果逐渐增加，当K2HPO4的质量浓度为0.75 g·L-1时，发酵效果最好(图5).

2.2.6 不同质量浓度MgSO4对菌株SCY114发酵效果的影响 从图6可以看出，MgSO4对菌株SCY114的发酵效果影响较大，培养基中加入MgSO4能明显提高抗生素产量，当MgSO4的质量浓度为0.25～0.5 g·L-1时，发酵效果最好.

2.3 发酵培养基正交试验结果

从表2中可以看出，4种因素对发酵效果的影响大小依次为:K2HPO4(D)＞ MgSO4(C)＞黄豆饼粉(A)＞可溶性淀粉(B).根据计算结果，理论优化方案为:A1B3C3D3，即正交试验设计表中的组合3，黄豆饼粉40 g·L-1、可溶性淀粉20 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.75 g·L-1，K2HPO41.0 g·L-1.

图5 K2HPO4质量浓度对抗生素产量的影响Fig.5 Effect of different potassium dihydrogen phosphate contents on antibiotic yield

图6 MgSO4质量浓度对抗生素产量的影响Fig.6 Effect of different magnesium sulfate contents on antibiotic yield

表2 正交试验结果Table 2 Orthogonal experiment results

为了验证此配方是否为最佳发酵培养基，对其进行重复试验，并与基础培养基的发酵效果进行比较.结果表明，优化后的培养基发酵效果明显优于基本培养基(图7).

图7 优化培养基与原始培养基发酵结果的比较Fig.7 Comparison between optimal medium and original medium

2.4 发酵条件对菌株SCY114发酵效果的影响

2.4.1 初始pH 值对菌株SCY114发酵效果的影响 在不同初始pH 值的培养基中，菌株SCY114的发酵效果有明显差异(图8).当初始pH 值为3.0时，不利于菌体生长而影响其次级代谢产物的产生和积累.随着pH 值升高，发酵效果逐渐增加，当pH 值为6.0～7.0 时，发酵效果达到最佳.当pH值大于7.0 时，发酵效果逐渐下降.因此，适合菌株SCY114 产素的最适初始pH 值为6.0～7.0.

2.4.2 温度对菌株SCY114发酵效果的影响发酵温度对菌株SCY114发酵效果有明显的影响，在25～30℃发酵效果较好，其中，28℃时发酵效果最好(图9).

图8 初始pH 值对抗生素产量的影响Fig.8 Effect of initial pH value on antibiotic yield

图9 温度对抗生素产量的影响Fig.9 Effect of temperature on antibiotic yield

2.4.3 转速对菌株SCY114发酵效果的影响 试验结果表明，转速对菌株SCY114发酵效果有一定的影响，当摇床转速为200 r·min-1时发酵效果最好(图10).

图10 转速对抗生素产量的影响Fig.10 Effect of rotational speed on antibiotic yield

2.4.4 摇瓶装量对菌株SCY114发酵效果的影响

随着摇瓶装液量的改变，菌株SCY114的发酵效果出现明显变化，其中250 mL 三角瓶装入70 mL时发酵效果最佳，即体积分数为28%的装液量有利于菌株次级代谢产物的积累(图11).

2.4.5 种龄对菌株SCY114发酵效果的影响 试验结果表明，菌株SCY114 在种子培养基中培养24～48 h后接种，对发酵效果影响不大，种龄超过48 h后，发酵效果逐渐降低(图12).考虑到种子培养时菌株生长的同步性和发酵成本，以种龄36 h为宜.

图11 装液量对抗生素产量的影响Fig.11 Effect of cultural broth volume on antibiotic yield

图12 种龄对抗生素产量的影响Fig.12 Effect of seed age on antibiotic yield

2.4.6 接种量对菌株SCY114发酵效果的影响试验结果表明，当接种量体积分数小于6%时，发酵效果逐渐增加;接种量为6%时，发酵效果最好;当接种量体积分数大于6%时，发酵效果逐渐降低(图13).

图13 接种量对抗生素产量的影响Fig.13 Effect of inoculation volume on antibiotic yield

2.4.7 发酵时间对菌株SCY114发酵效果的影响

在相同的发酵条件下，菌株SCY114的活性代谢物产量随着发酵时间的延长逐渐升高，在第5 d时，抗生素产量达到高峰，此后，随着发酵时间延长，抗生素产量趋于稳定，与第5天的产量基本维持在同一水平(图14).由此可见，5 d 是其发酵最佳时间，既保证了抗生素的产量，又节约了成本，同时也避免了发酵时间过长导致菌丝体自溶而影响代谢活性物质的积累.

图14 发酵时间对抗生素产量的影响Fig.14 Effect of fermentation time on antibiotic yield

3 结论与讨论

通过对生防菌株SCY114发酵培养基及发酵条件的优化，得出菌株SCY114 最佳培养基配方为:可溶性淀粉20 g·L-1、黄豆饼粉40 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.75 g·L-1和K2HPO41.0 g·L-1.最佳摇瓶发酵条件为:初始pH 值7.0，发酵温度28℃，种子液种龄36 h，接种量6%，装液量70 mL三角瓶(250 mL)，转速200 r·min-1，发酵时间5 d.可溶性淀粉和黄豆饼粉作为菌株的主要营养成分，达到了降低成本提高效价的目的，为进一步的试验发酵奠定了基础.

微生物发酵生产中，为了提高抗生素的产量，既要提供丰富的营养物质，满足微生物菌体生长、代谢产物积累的需要，也要考虑原料的成本和来源.碳源筛选试验中，葡萄糖和可溶性淀粉对抗生素产量都有较大的提高，但葡萄糖作为试验室的生化试剂，价格高，不适于作为工业化生产的主要碳源，因此，选用可溶性淀粉为最佳碳源，但是，培养基中过量的碳源不利于次级代谢产物的积累，发酵过程控制时不必进行碳源补给;氮源筛选试验中，用黄豆饼粉和燕麦粉做氮源时，发酵效果均较其他氮源好，考虑到黄豆饼粉是发酵工业中最常用的有机氮源，蛋白质含量可达40%左右，并且其中硫氮基酸的含量较高，能促进菌丝生长和代谢产物的积累［14］，且原料来源丰富，故选用黄豆饼粉为最佳氮源.

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