文心兰GAPDH基因片段的克隆及序列分析

张国付，蒋素华，崔 波，，袁秀云，田云芳，叶永忠

(1.河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 450002；2.郑州师范学院生物工程研究所，河南 郑州 450044)

3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)是糖酵解途径中的一种关键酶，催化3-磷酸甘油醛转变为l，3-二磷酸甘油醛，同时以NAD+为受氢体生成NADH.GAPDH 高度保守，一直以来被认为是仅存于细胞质中的管家基因产物，在同种细胞或组织中表达量恒定，故被广泛用作细胞质蛋白标准化的内参.GAPDH 在细胞质、细胞核及细胞膜上均有定位，其表达量在转录及转录后水平受到调节，mRNA 水平和蛋白水平会随着各种刺激而变化［1］.人们在利用半定量RT-PCR 方法研究基因表达时，需引入一些参照基因，以此来控制试验误差并对结果进行标准化处理［2-4］.而在植物研究领域常用的内参照基因有β-肌动蛋白(β-actin)、3-磷酸甘油醛脱氢酶，18S rRNA，G3PDH(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase，3-磷酸甘油脱氢酶)等［5，6］.其中GAPDH基因因具有高度的保守性，通过比较不同物种GAPDH基因核苷酸或氨基酸序列的异同，可对物种进行分类和建立各物种之间的系统发育关系［7，8］.迄今为止，众多研究表明已从许多高等植物如小麦［9］、水稻［10］、谷子［11］、擎天凤梨［12］、三七［5］等克隆到了GAPDH基因，但有关文心兰GAPDH基因的克隆和研究还未见报道.文心兰系兰科(Orchidaceae)文心兰属(Oncidium Swartz)兰花的总称，属复茎类洋兰，附生或地生，原产墨西哥、西印度群岛、巴西等地，近年来中国华南、华东地区已广泛引种栽培.本研究以文心兰的花期花葶为试验材料，用RT-PCR 方法克隆了GAPDH基因的部分cDNA 序列，以此基因作为内参基因，为研究其生理功能及其他基因在文心兰中的表达和调控奠定基础.

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

文心兰来自郑州师范学院智能温室.取文心兰花期的花葶在液氮中速冻后，存于-80℃冰箱保存备用.限制性内切酶、TaqDNA 聚合酶、T4-DNA连接酶、DNA Marker 等工具酶均为宝生物工程(大连)有限公司产品;新型植物RNA 提取试剂盒、质粒小提试剂盒，普通琼脂糖DNA 回收试剂盒、IPTG，X-Gal，dNTP为天根生化科技(北京)有限公司产品.其他试剂均为国产分析纯.所用质粒pMD19-T和大肠杆菌DH5α 均购自TaKaRa 公司.

1.2 文心兰GAPDH基因的克隆

1.2.1 文心兰花葶总RNA的提取 将文心兰花期花葶在液氮中研磨至粉状，用Trizol(Invitroigen公司)试剂提取其总RNA，用琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性.

1.2.3 cDNA 单链合成 反转录反应参照Ferrnentas RevertAidTM First strand cDNA synthesis Kit使用说明，用M-MLV 反转录酶(TaKaRa 公司)合成的第1 链cDNA 于-20℃保存.

1.2.4 引物合成与RT-PCR 扩增 通过对NM_101214.3(拟南芥)、NM_001084061.1(拟南芥)、EF408234.1(甜菜)、DQ355800.1(大豆)、L07500.1(豌豆)、GQ848032.1(水稻)等植物GAPDH基因的核苷酸序列进行同源性比较，找出高度保守的区段，利用Primer 5.0和DNAMAN 生物软件设计1对简并引物Sense primer:5′-AA(G/A)ATCG-GAATCAA(T/C)GG(G/A)TTCG-3′和Antisense primer:5′-TC(A/T)G(C/A)(C/T)TCCTCCTTGAT(T/G)GC-3′，引物由上海英骏生物技术公司合成.

以文心兰cDNA为模板进行PCR 扩增.反应体系:10×PCR buffer 2.0μL，dNTP(2.5μmol·L-1)2.0μL，F，R(10μmol·L-1)各0.4μL，Taq DNA 酶(10 U·μL-1)0.2μL，模板DNA0.5μL，定量补足ddH2O 至20μL.反应条件:95℃预变性3 min，95℃变性30 s，58℃复性40 s，72℃延伸40 s，30个循环，最后72℃延伸10 min.PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，按照凝胶回收试剂盒说明进行回收，最终得到30μL的产物.

1.2.5 构建重组质粒 取4μL 回收产物连接到pMD19-T vector，构建重组质粒，操作方法按试剂盒说明书进行.将重组质粒转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞，涂布在含有50 mg·L-1氨苄青霉素，IPTG和X-Gal的LB 固体培养基上，置于37℃培养箱培养12～16 h，蓝白斑筛选重组子.

1.2.6 重组质粒的鉴定和测序分析 阳性克隆通过摇菌扩增，按照质粒小提试剂盒提取质粒，并对提取的质粒进行PCR 鉴定，最后将阳性质粒送上海英骏生物技术公司测序.测序结果通过DNAMAN和Primer5.0 生物软件进行序列多重比较和翻译，同源性在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)网站上进行Blast 搜索.

2 结果与分析

2.1 文心兰花葶总RNA的质量分析

由图1可见，所提取文心兰总RNA的28S和18S 条带完整清晰，且28S的亮度是18S的2倍左右，表明所提取总RNA 完整性较好，没有降解.紫外分光光度法测得OD260/OD280的比值介于1.8～2.0，表明总RNA的纯度较高，没有糖、蛋白质等污染.

图1 文心兰花葶总RNA的提取Fig.1 Extraction of total RNA

2.2 文心兰花葶GAPDH基因的扩增

用材料与方法中所设计的引物，以文心兰花葶的cDNA为模板，经PCR 扩增得到了880 bp 左右的片段(图2)，这个片段与预期长度基本相同，并对此扩增产物进行纯化回收.

图2 文心兰花葶目的基因的扩增Fig.2 Amplification of target gene

2.3 GAPDH基因cDNA 克隆

对上述回收的产物连接到pMD19-T，并转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞中进行菌落培养，挑取白斑进行菌落PCR 扩增，并电泳检测，发现得到的片段与上述以cDNA为模板得到的扩增产物长度相同，对经检测无误的2个白斑菌进行摇菌提取质粒后，对质粒进行PCR 检测，各有1 条约880 bp 左右的条带，证明PCR 扩增的片段已克隆到pMD19-T载体上.

2.4 GAPDH基因cDNA 序列测定和分析

测序结果表明，所获得的2 条GAPDH基因cDNA片段的长度均为875 bp，编码291个氨基酸残基，与预计结果相符，同源性比较结果显示，该片段的核苷酸序列与其他植物GAPDH基因的核苷酸序列的同源性均在79%～92%之间，其中同源性最高的是蕙兰(JN177724.1)92%，与蝴蝶兰的同源性为89%(图3)，所克隆的2个GAPDH基因cDNA片段氨基酸序列同源性与其他植物氨基酸序列的同源性也均在85%以上，反映出该基因在进化上较为保守，表明已克隆出GAPDH基因的部分cDNA 序列.将这2个GAPDH基因的cDNA片段分别命名为OnGA1和OnGA2，并在GenBank 注册，登录号分别为JN981141和JN981142.同时在GenBank中未查询到文心兰的GAPDH基因.

图3 文心兰GAPDH基因序列比对分析Fig.3 Multiple sequence alignment of GAPDH gene in Oncidium

采用DNAMAN 生物分析软件，对文心兰GAPDH基因及玉米DQ245685.1、甘蔗EF189713.1、狼尾 草GQ398107.1、水 稻GQ848032.1、凤 梨HM768296.1、三叶草JF968420.1、胡萝卜JN086968.1、蕙兰 JN177724.1、蝴 蝶 兰 JN185660.1、大 麦M36650.1、拟南芥NM _101214.3、大豆NM _001253117.1、芥 菜 X04301.1、苜 蓿 XM _003601780.1 等植物GAPDH基因核苷酸序列进行多序列比对，并将比对结果用DNAMAN 软件构建分子系统树(图4).结果表明，所克隆到的2个GAPDH基因与蕙兰(JN177724.1)同源性最高，它们来自同一个进化分枝;其次是蝴蝶兰(JN185660.1)，而与胡萝卜(JN086968.1)的同源性最低.从图4 还可以看出，同源性高的均为单子叶植物，同源性低的均为双子叶植物.

图4 GAPDH 系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of GAPDH

3 结语

本研究报道了来自于文心兰GAPDH基因的2个cDNA 序列片段，片段长度均为875 bp，编码291个氨基酸残基，其核苷酸序列和氨基酸序列与其他植物的GAPDH 具有广泛的同源性，其中与蕙兰(JN177724.1)和蝴蝶兰(JN185660.1)的相似性最高，表明本试验克隆出的基因片段为文心兰GAPDH基因，且具有高度的保守性，说明其功能的重要性，并在 GenBank 登录，登录号分别为JN981141和JN981142，为进一步研究其生理功能及其他基因在文心兰中的表达和调控奠定了基础.

通过采用NCBI的Blast 工具对文心兰GAPDH基因进行分析，结果显示，不论是双子叶植物还是单子叶植物，GAPDH的核苷酸和氨基酸序列都有较高的同源性，这一高度保守性与其在植物糖酵解途径中功能的高度保守密切相关.这使得GAPDH基因在生物体的不同组织细胞中或同一组织细胞的不同生理状态下表达量相对稳定.本研究结果表明，文心兰的GAPDH基因在花期花葶中高度表达，为进一步研究其生理功能和其它基因提供信息基础.

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