Fbxl10通过PI3K途径促进肺癌细胞增殖和侵袭

顾金香， 李凯锐， 吴家涛， 王璐瑶， 武世伍

(1. 蚌埠医学院基础医学院病理学系，安徽 蚌埠 233034； 2. 蚌埠医学院第一附属医院病理科，安徽 蚌埠 233034)

肺癌是威胁人类健康最常见的恶性肿瘤之一，死亡率居高不下。根据组织病理学特点，肺癌主要分为非小细胞肺癌(non-smallcell lung cancer, NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)两种类型，NSCLC占肺癌的80%。肿瘤细胞转移是肺癌的恶性生物学特征之一，也是临床治疗失败的原因之一，发生转移的患者已处于肿瘤的晚期而失去了手术的机会[1]。化疗曾是治疗NSCLC的常用方法，但其副作用大，部分患者疗效不确定。随着细胞和分子生物技术的迅速发展，对患者关键基因和调控分子进行个体化干预成为治疗热点[2]。

组蛋白去甲基化酶Fbxl10是泛素连接酶(Skp1-Cullin-F-box, SCF)复合体中的一种受体蛋白，它通过泛素化降解目标分子从而调控细胞的生物学过程[3]。近年来，Fbxl10与肿瘤的发生发展受到关注。研究发现，Fbxl10参与了前列腺癌[4]、胃癌[5]、结肠癌[6]以及肺鳞癌[7]等多种肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭过程。Fbxl10对肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其机制尚不完全清楚，本研究通过细胞分子生物学技术探索Fbxl10在肺腺癌细胞中的表达和生物学作用以及潜在的作用机制，以期为肺腺癌治疗的新靶点提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与主要仪器

Fbxl10过表达质粒、阴性对照质粒、Fbxl10 siRNA购自上海吉凯基因科技有限公司；Lipo-fectamine 3000转染试剂购自美国Invitrogen公司；Fbxl10抗体购自美国Affinity Biosciences公司；PI3K抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；TRIzol试剂、反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；PCR扩增实验试剂盒购自北京全式金生物技术公司；胎牛血清购自美国Clark Bioscience公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自美国Sigma公司；RPMI 1640培养基购自美国Hyclone公司；Transwell小室、基质胶购自美国BD公司；结晶紫溶液购自上海碧云天生物科技有限公司。

倒置显微镜购自日本Olympus公司；生物安全柜购自上海力康生物医疗科技控股有限公司；高速离心机购自德国Eppendorf公司；微型离心机购自美国AndyBio公司；PCR扩增仪购自美国Bio-Rad公司；酶标仪购自美国Biotek公司。

1.2 实验分组

肺腺癌细胞株H1299(购自上海信裕生物科技有限公司)分为4组。空白对照组(Ctrl组): H1299肺腺癌细胞株，不作任何处理；阴性质粒对照组(NC组): 使用没有连接目的基因Fbxl10的质粒转染肺腺癌H1299细胞株；过表达组(Fbxl10OE组): 使用成功整合目的基因Fbxl10的质粒转染至肺腺癌H1299细胞株；干扰组(siFbxl10组): 使用RNA干扰技术特异性剔除目的基因Fbxl10，脂质体法转染至肺腺癌H1299细胞株。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养和细胞转染 在RPMI 1640培养基中添加10%浓度的血清和1%青霉素-链霉素，配成完全培养基，将肺腺癌细胞H1299株放入含5%CO2的37 ℃细胞培养箱中培养，1～2 d换液，待细胞长至75%以上后进行传代处理。细胞转染: 消化后收集细胞，将细胞充分混匀后计数，接种于六孔板内，每孔约2×105细胞，24 h后待细胞长至70%～90%汇合度转染为NC组、Fbxl10OE组和siFbxl10组，转染过程严格按照Lipofectamine 3000说明书进行操作，在荧光显微镜下观察转染情况，2～3 d完成转染。

1.3.2 细胞克隆形成实验 细胞转染36 h后收集细胞并计数，六孔板每个孔内接种500个细胞，期间每隔2～3 d换液1次，并观察克隆形成情况，2周后显微镜下观察到有明显的克隆群落形成，倒掉孔内培养液，PBS洗2遍，0.1%结晶紫溶液染色25 min，纯水冲洗六孔板后拍照。Image J软件处理图片转换为数据并作柱状图分析。

1.3.3 MTT法测细胞增殖活力 细胞转染后36 h收集细胞并计数，96孔板每孔接种5 000个细胞，设置4个复孔，72 h后每孔加20 μL加MTT溶液，继续培养4 h后终止培养，小心吸去孔内含有MTT的培养液，每孔加200 μL DMSO溶液，置摇床低速振荡20 min，让其充分溶解甲臜结晶，用酶联免疫检测仪测量各个孔的光密度(D490)值。

1.3.4 细胞划痕愈合实验 细胞转染于六孔板36 h，用10 μL白吸头在六孔板内小心地划一条直线(记为0 h)，然后在显微镜下拍划痕的孔隙照片，保存图片。于划痕24 h后观察细胞的迁移及愈合情况(记为24 h)，在显微镜下拍照，保存图片用Image J软件处理图片转换为数据并作柱状图分析。

1.3.5 Transwell迁移和侵袭实验 将细胞转染36 h后的各组细胞用胰酶消化2 min，再加RPMI 1640培养基终止消化，1 000 r/min，离心半径13.5 cm，离心2 min，用RPMI 1640培养基混悬细胞沉淀，再用细胞计数板计数，加RPMI 1640培养基反复吹打充分混匀后，将细胞密度分别调整至1×105/mL和2.5×105/mL，用于Transwell迁移实验和侵袭实验。小室上室加入200 μL细胞悬液，下室加入800 μL含20%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37 ℃、5%CO2恒温箱中培养24 h后，取出小室，弃掉其中的培养基，放回24孔板，再加PBS轻柔润洗2次，用棉签轻轻擦掉上室细胞，加4%多聚甲醛溶液固定细胞15 min，弃去后加0.1%结晶紫溶液染色20 min，弃去后加PBS清洗2次，室温干燥。显微镜下随机选取5个视野进行拍照，保存图片，用Image J软件统计小室细胞的迁移数，取平均值进行统计分析。

1.3.6 实时荧光定量PCR分析(qRT-PCR) 将转染后的Fbxl10OE组、siFbxl10组、NC组和未转染的Ctrl组分别进行RNA提取。使用TRIzol试剂从培养的细胞中提取总RNA，加氯仿萃取，使其分层，再用异丙醇、乙醇提纯，最后加适量的DEPC水稀释为合适的浓度，再按照试剂盒说明书进行反转录成cDNA，按照荧光定量PCR试剂盒说明书PCR的扩增过程，上机检测循环过程的荧光，收集荧光数据进行后续的分析。结果用2-ΔΔCt法解释。使用Primer 5.0设计引物见表1。实验重复3次。

表1 引物序列Tab.1 The primer sequences

1.3.7 Western印迹实验 将转染后的Fbxl10OE组、siFbxl10组、NC组和未转染的Ctrl组分别进行总蛋白提取。收集转染后的细胞，加RIPA和PMSF混合裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)，用吸头反复吹打至拉丝为止，然后放在冰上裂解30 min，期间每隔10 min涡旋振荡15 s，4 ℃预冷，12 000 r/min，离心半径13.5 cm，离心15 min，BCA试剂盒进行蛋白定量检测。根据所测浓度加样后进行SDS-PAGE电泳，电泳过后转膜至PVDF膜，无蛋白快速封闭液封闭10 min，一抗孵育12～15 h(4 ℃冰箱)，第2天用TBST洗膜3次，每次10 min，再进行室温孵育二抗2 h，发光液按照1∶1比例配成后让条带显影，用化学发光仪对条带进行曝光扫描，Image J软件计算灰度值比值进行蛋白表达的相对定量分析。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 细胞克隆实验

通过脂质体转染法将过表达质粒、阴性质粒和干扰RNA，分别转染至肺癌H1299细胞，转染后检测H1299细胞的克隆形成群落数情况，用Image J软件进行分析，以阴性质粒组为对照组，结果显示，Fbxl10OE组形成的克隆群落数比NC组多[(36.792±0.003)vs(15.098±0.982)，n=3]，差异有统计学意义(P<0.01)，siFbxl10组形成的克隆群落数比NC组少[(5.021±0.925)vs(15.098±0.982)，n=3]，差异有统计学意义(P<0.01)。上调Fbxl10表达，H1299细胞的克隆形成能力增强，群落数增多；下调其表达，则H1299细胞的克隆形成能力减弱，群落数减少，见图1A。

2.2 MTT实验

MTT实验结果显示，在H1299细胞中分别转染过表达质粒、阴性质粒和干扰RNA，以阴性质粒组为对照组，Fbxl10OE组的D490高于NC组[(1.073 8±0.359 1)vs(0.712 9±0.073 2)，n=3]，差异有统计学意义(P<0.01)，siFbxl10组的D490低于NC组[(0.426 7±0.844 2)vs(0.712 9±0.073 2)，n=3]，差异有统计学意义(P<0.05)。说明上调Fbxl10表达，H1299细胞的增殖活力增强，下调其表达，则H1299细胞的增殖活力被抑制，见图1B。

图1 各组肺癌细胞克隆增殖实验及细胞活力实验Fig.1 Overexpression of Fbxl10 promoted the clonal proliferation and cell viability of lung cancer cellsA: 各组肺癌H1299细胞的克隆实验；B: 各组克隆实验及MTT实验比较，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.3 细胞划痕愈合实验

通过脂质体转染法将过表达质粒、阴性质粒和干扰RNA分别转染至肺癌H1299细胞，观察上调或下调Fbxl10后肺癌H1299细胞的生长情况，24 h 后拍照观察其划痕愈合情况，检测其迁移能力。与NC组相比，Fbxl10OE组的愈合迁移距离明显增加[(375.7±3.4)vs(121.8±6.6)，n=3]，差异有统计学意义(P<0.01)，而siFbxl10组愈合迁移距离明显减少[(36.3±7.9)vs(121.8±6.6)，n=3]，差异有统计学意义(P<0.01)。细胞划痕实验结果说明，上调Fbxl10，H1299细胞的迁移形成能力增强，下调Fbxl10则H1299细胞的迁移形成能力减弱，见图2A。

2.4 Transwell迁移和侵袭实验

通过脂质体转染法将过表达质粒、阴性质粒和干扰RNA分别转染至肺癌H1299细胞，观察上调或下调Fbxl10后肺癌H1299细胞的生长情况。转染后，用Transwell迁移和侵袭实验检测H1299细胞的迁移和侵袭能力。Transwell迁移实验显示、Fbxl10OE组透过小室的细胞数比NC组多[(327.5±9.2)vs(187.7±13.6)，n=3]，差异有统计学意义(P<0.01)；siFbxl10组透过小室的细胞数比NC组少[(84.2±4.9)vs(187.7±13.6)，n=3]，差异有统计学意义(P<0.01)。Transwell侵袭实验显示，Fbxl10OE组透过Matrigel基质胶的细胞数比NC组多[(180.9±12.4)vs(120.3±4.7)，n=3]，差异有统计学意义(P<0.01)，而siFbxl10组透过Matrigel基质胶的细胞数比NC组少[(37.3±6.5)vs(120.3±4.7)，n=3]，差异有统计学意义(P<0.01)。Transwell侵袭实验结果说明，上调Fbxl10表达，H1299细胞的迁移、侵袭能力增强，下调其表达，则H1299细胞的迁移、侵袭能力减弱，见图2B。

图2 各组划痕、迁移和侵袭实验结果Fig.2 Fbxl10 promoted the migration and invasion of lung cancer cellsA: 各组H1299细胞划痕愈合实验；B: 各组H1299细胞的Transwell迁移和侵袭实验(结晶紫染色)

2.5 qRT-PCR实验和Western印迹实验

通过脂质体转染法将过表达质粒、阴性质粒和干扰RNA分别转染至肺癌H1299细胞，结果如图3A、B所示，qRT-PCR实验及Western免疫印迹实验发现，转染过表达质粒时成功上调H1299细胞中Fbxl10 mRNA和蛋白表达，差异有统计学意义(P<0.01)；敲低其表达时也成功下调H1299细胞中Fbxl10 mRNA和蛋白的表达(P<0.01)。而随着Fbxl10表达上调，PI3K蛋白表达也上调(P<0.01)，qRT-PCR结果显示，随着Fbxl10上调，PI3K mRNA水平也相应增高(P<0.01)，但蛋白表达差异不明显，见图3。

图3 Fbxl10过表达后Fbxl10及PI3K表达均增加Fig.3 After H1299 cells was transfected with Fbxl10OE, both Fbxl10 and PI3K expressions increasedA: H1299细胞中Fbxl10和PI3K相对mRNA表达；B: H1299细胞中Fbxl10和PI3K相对蛋白的表达；*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1

3 讨 论

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，5年生存率约为6%。肺癌的组织学类型中约80%为NSCLC，其中肺腺癌(lung adenocarcinoma, LA)是NSCLC的主要亚型，具有独特的组织学特征,与肺鳞状细胞癌相比，更容易发生早期转移。尤其是中低分化腺癌，通常被诊断时已发生了远处转移，局部更容易对正常肺组织形成侵袭和破坏。在过去的几十年里，靶向治疗和免疫治疗已被广泛应用于NSCLC的治疗。尽管已经发现了一些靶向治疗肺腺癌的驱动基因，但由于肺癌的表型特征较多，需要研究和发现更多的靶向驱动基因以满足个体化治疗的需要。表观遗传因子在肺癌的精准诊断和个体化治疗上已经引起了关注[8]，Fbxl10对肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其机制目前尚不完全清楚。

Fbxl10是一种组蛋白去甲基化酶，是二甲基和三甲基H3K79脱甲基酶[9]。表观遗传学(epigenetics)修饰包括DNA甲基化、组蛋白翻译后修饰、核小体定位和非编码RNA调控的转录后基因调控。其中，目前研究最深入的是DNA甲基化和组蛋白修饰[10]。组蛋白的修饰包括磷酸化、甲基化、泛素化和乙酰化等，其中组蛋白甲基化修饰在转录后调控过程中起重要作用。Fbxl10是JmjC家族的重要成员，在哺乳动物细胞中普遍表达[11]，Fbxl10除含有JmjC结构域外，还含有一个CXXC-zinc-finger结构域、PHD结构域(plant homeodomain)、F-box结构域和富含亮氨酸的重复结构域[12-13]。JmjC结构域是其发挥去甲基化酶活性所必需的，Fbxl10通过CXXC锌结构域募集多梳抑制复合物1(polycomb repressive complexes 1, PRC1)到未甲基化CpG区来影响DNA甲基化和基因沉默[14]。Fbxl10是泛素连接酶SCF复合体中的一种受体蛋白，它通过泛素化降解目标分子而发挥调控细胞生物学过程的作用。

在细胞的正常生理代谢中，Fbxl10可以发挥多种调控作用。本研究发现转染Fbxl10过表达质粒时成功上调H1299细胞中Fbxl10 mRNA或蛋白的表达；转染Fbxl10干扰RNA时也成功下调H1299细胞中Fbxl10 mRNA或蛋白的表达。本研究发现与NC组比较，过表达Fbxl10时，PI3K的mRNA或蛋白也随之而升高，敲低Fbxl10时，PI3K的mRNA或蛋白也随之而下降。过表达Fbxl10后，该肿瘤细胞的增殖、迁移能力增强，敲低表达后则作用相反。因此设想，Fbxl10促进癌细胞增殖和侵袭能力有可能是通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路实现的[5]。

PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，多年来，它在健康和疾病方面的功能一直是研究的焦点[15-16]。PI3K/AKT/mTOR信号通路也是抗癌药物开发的主要靶点[17]。研究发现，使用PI3K激活剂SLC39A5，可以激活PI3K/AKT信号通路在肺腺癌中发挥致癌作用[18]。PI3K/mTOR通路可能是参与肺癌进展的一个关键机制。考虑到Fbxl10在肿瘤发展中的关键作用，本研究通过过表达Fbxl10后，PI3K表达量也相应增加，Fbxl10可能通过靶向PI3K/mTOR途径在肺腺癌进展中发挥重要作用。已有研究发现[7]，Fbxl10可以通过调节雷帕霉素通路的磷脂酰肌醇3-激酶/AKT/哺乳动物靶蛋白，抑制糖酵解并诱导肺鳞癌细胞自噬；敲除Fbxl10可抑制肺鳞癌的体外细胞增殖和体内肿瘤生长[7]。本研究细胞学实验显示，在肺腺癌细胞中过表达Fbxl10，可以促进肺腺癌细胞株H1299的增殖、迁移和侵袭能力，同时也可以促进PI3K的表达，由此推测，Fbxl10促进癌细胞增殖和侵袭能力有可能通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路实现的。这也是该基因对肺癌的调控作用的一种补充。

H1299细胞系是从NSCLC患者的肺细胞中建立的，广泛应用于生物医学研究，作为一种永生化细胞系，可以无限地分裂。本研究结果提示Fbxl10在肺癌细胞的侵袭、转移中起重要作用，Fbxl10有望成为抗肿瘤转移治疗的潜在靶点。未来研究的重点是进一步对Fbxl10的结构、功能及作用机制进行深入探讨，以及对其抑制剂开展研究，为Fbxl10最终成为抗肺腺癌转移治疗的新靶标打下坚实的基础。