单硝酸异山梨酯上调外泌体-microRNA378表达减轻机械牵张诱导的心力衰竭

张卫君， 刘琳琳， 林　利

(同济大学附属东方医院心血管内科，上海　200120)

目前，心力衰竭的发病率越来越高，正成为21世纪的最重要病症[1]。虽然近年来心力衰竭的药物治疗和器械治疗都取得了长足的进步[2]，然而心力衰竭的死亡率仍然很高，长期预后仍然不佳[3]。压力超负荷导致的心肌重构是引发心力衰竭的重要因素[4]。单硝酸异山梨酯(isosorbide mononitrate, ISMN)可用于治疗急性心力衰竭及冠心病所致的慢性心力衰竭[5-6]。然而ISMN在压力超负荷所致的心力衰竭中的作用却鲜有报导。外泌体是一种几乎所有细胞都能分泌的球形或杯型微囊，内含各种蛋白、RNA(主要是microRNAs)和脂质等活性成分[7]。MicroRNA是在细胞内广泛存在的，在转录后水平对基因表达进行调控。越来越多的研究[8-9]表明，MicroRNA在心力衰竭的发生、发展中起着重要作用。故本研究探讨ISMN在压力超负荷诱导的心力衰竭中的作用及与外泌体-microRNA378的关系。

1　材料与方法

1.1　动物模型及分组干预

通过升主动脉缩窄术(transverse aortic constriction, TAC)构建小鼠心力衰竭模型： 15只8周龄C57BL/6雄鼠，分为对照组(control组)、升主动脉缩窄组(TAC组)、升主动脉缩窄+单硝酸异山梨酯组(TAC+ISMN组)，每组5只。腹腔注射氯胺酮(100mg/kg)麻醉后，仰卧于手术台，气管插管，剪断左侧第2肋骨后，拨开胸腺，暴露升主动脉弓。27G针头沿升主动脉自然生长方向放置，5个0丝线把主动脉结扎后，取出针头，即造成升主动脉缩窄小鼠模型。缩窄程度70%～80%，持续4周，诱导心力衰竭。对照组只穿线不结扎。升主动脉缩窄+ISMN组TAC术前3d给小鼠灌胃ISMN 30mg/(kg·d)，连续灌胃4周。

1.2　超声检测

建模及干预4周后，使用Vevo770超声诊断仪和30MHz高频探头(加拿大Visual Sonics公司)进行小鼠的心脏超声检查，检测左心室舒张末期内径(left ventricular internal diameter at end diastole, LVIDd)、左心室舒张末期前壁厚度(left ventricular anterior wall thickness at end diastole, LVAWd)、短轴缩短率(short-axis fractional shortening, FS)。

1.3　取血及标本处理

超声后通过眼球取血法取血，离心后获血浆进一步处理，通过鼠氨基端前脑钠素ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)测各组血浆NT-proBNP水平，剩余血浆通过Exo-Quick试剂盒(SBI公司)提取血浆外泌体，提取RNA,RT-qPCR测外泌体-microRNA378表达水平。取血后，脱颈椎处死小鼠，迅速取出心脏，用生理盐水冲净残余血，滤纸吸干心脏，称重。取左心室垂直于长轴厚约3mm的心肌组织块，放入10%甲醛固定，H-E染色后，光学显微镜下观察心肌细胞形态。

1.4　心肌细胞培养及干预

心肌细胞取自出生1d的新生大鼠，放入加有鼠尾胶原的硅胶皿中，10%胎牛血清、青霉素、链霉素，DMEM培养基培养48h后，换无血清培养基培养过夜。分为5组： 对照组、牵张组、牵张+microRNA378类似物组、牵张+ISMN组、牵张+ISMN+microRNA378抑制剂组。牵张器牵张48h收集细胞提取RNA，RT-qPCR检测ANP和SAA的表达。牵张前24h，牵张+ISMN+microRNA378抑制剂组、牵张+microRNA378类似物组分别转染microRNA378抑制剂25pmol和microRNA378类似物25pmol。牵张前30min牵张+ISMN组，牵张+ISMN+microRNA378抑制剂组加入ISMN(100μg/mL)。

1.5　统计学处理

应用SPSS21.0软件进行统计学分析，对符合正态分布的样本，进行独立样本t检验，图表用Graphprism7.0软件绘制。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1　在体验证ISMN对轻机械牵张诱导的心力衰竭的作用

TAC组较对照组LVIDd、LVAWd升高(P<0.01),而FS明显下降(P<0.01)，提示TAC后小鼠心室肥厚，心腔扩大，收缩功能下降，造模成功;而TAC+ISMN组LVIDd、LVAWd较TAC组明显下降(P<0.01、P<0.05)，FS升高(P<0.05)，提示ISMN能减轻机械牵张诱导的心力衰竭，改善心功能，见图1A～C及图2A～C。肉眼看心脏大体标本，TAC组心脏最大,质量最大，对照组心脏最小，质量最小，TAC+ISMN组心脏在两者之间，见图1D～F。TAC组及TAC+ISMN组心质量/体质量较对照组明显升高(P<0.01),TAC+ISMN组心质量/体质量较TAC组明显下降(P<0.01)，见图2D。H-E染色显示： TAC组较对照组心肌细胞肥厚明显，而TAC+ISMN组较TAC组心肌肥厚减轻，见图1G～I。TAC组及TAC+ISMN组NT-proBNP水平较对照组明显升高(P<0.01),TAC+ISMN组NT-proBNP水平较TAC组下降(P<0.01)，见图2E。以上结果证实ISMN能减轻压力超负荷诱导的心力衰竭，改善心功能。

2.2　ISMN对慢性心力衰竭小鼠血浆外泌体-microRNA378的作用

RT-qPCR检测发现，TAC组较对照组外泌体-microRNA378水平明显下降(P<0.01)，而TAC+ISMN组较TAC组外泌体-microRNA378明显上升(P<0.05)，见图3。说明压力超负荷所致慢性心力衰竭血浆外泌体-microRNA378会下降，而ISMN能上调压力超负荷诱导心力衰竭小鼠血浆外泌体-microRNA378的水平。

图1　TAC术后4周心超、心脏形态及心肌H-E染色Fig.1　Echocardiography, heart morphology and HE-stained left ventricular sections of mice after 4-week transverse aortic constrictionA、B、C为心脏超声；D、E、F为心脏形态；G、H、I为心脏H-E染色

图2　TAC术后4周相关心功能指标Fig.2　The results of the relevant cardiac function indexes after 4-week of transverse aortic constrictionA： LVIDd, B： LVAWd, C： FS, D： HW/BW, E： NT-proBNP；与对照组相比,*P<0.05，**P<0.01；与TAC组比，#P<0.05,##P<0.01

图3　TAC 4周后外泌体-microRNA378表达水平Fig.3　The expression of exosomal-microRNA378 after 4-week transverse aortic constriction与对照组相比,*P<0.05，**P<0.01；与TAC组比，#P<0.05,## P<0.01

2.3　离体水平验证ISMN对机械牵张的作用及机制

牵张组较对照组胎儿基因ANP、SAA表达明显增加(P<0.01)，提示机械牵张诱导的心室肥厚造模成功；牵张+ISMN组较牵张组ANP、SAA表达下降(P<0.05)，提示ISMN能减轻机械牵张诱导的心力衰竭；牵张+microRNA378类似物组较牵张组ANP、SAA表达下降(P<0.05)，与牵张+ISMN组类似，而牵张+ISMN+microRNA抑制剂组较牵张组ANP、SAA下降不明显，ISMN的作用被拮抗，见图4。上述结果在离体水平证实ISMN能减轻机械牵张所致的心力衰竭，且可能是通过上调microRNA378实现的。

图4　牵张48h后ANP、SAA表达水平Fig.4　The expression of ANP and SAA after 48-hour of mechanical stretch与对照组相比,*P<0.05，**P<0.01；与牵张组相比，#P<0.05,##P<0.01

3　讨　　论

ISMN是继硝酸异山梨酯后的长效硝酸酯类药物，硝酸酯类药物的主要作用机制是在血管平滑肌细胞中通过生物转化，释放出一氧化氮，刺激细胞内环磷酸鸟苷水平增加，引起一系列生物学效应： 主要表现为血管扩张，既扩张静脉，同时也扩张动脉和小动脉平滑肌，减少左心室射血阻力，降低左心室前负荷，同时增加心排出量及心搏指数。硝酸酯类药物在临床上作为血管扩张剂被广泛应用于治疗急性心力衰竭[5]。而在慢性心力衰竭中，最新发布的ACC/AHA/HFSA联合制定的《2017 ACC/AHA/HFSA心力衰竭处理指南更新》[10]仍不推荐慢性心力衰竭患者常规应用硝酸酯类药物来增加体力活动和生活质量及常规进行营养补充。这主要是因为血管扩张剂使小动脉扩张，外周阻力、血压下降，结果可通过压力感受器反射性兴奋交感神经，激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统，增加肾素和醛固酮分泌，导致水钠储留。这类血管扩张剂虽能改善血流动力学，但不能降低心力衰竭的死亡率。故本研究探讨ISMN在压力超负荷诱导的慢性心力衰竭中的作用，通过升主动脉缩窄术4周及牵张48h构建压力超负荷诱导慢性心力衰竭的在体及离体模型，TAC+IMSN组较TAC组LVIDd、LVAWd明显下降(P<0.05)，FS明显升高(P<0.05)，HW/BW明显下降(P<0.01)。光镜下显示，心肌肥厚减轻，血浆NT-proBNP水平明显下降(P<0.01)，在体水平证实ISMN能减轻压力超负荷诱导的心力衰竭，改善心功能。牵张+ISMN组较牵张组，胎儿基因ANP、SAA的表达下降(P<0.05)，离体水平证实ISMN能减轻牵张所致的心肌肥厚。与之前的文献报导ISMN能减轻机械应力所致的心室肥厚和纤维化的结果相一致[11]。

近年来，外泌体由于其潜在的治疗价值获得了大量关注。目前已经有大量的研究探寻外泌体在肿瘤[12]、神经系统疾病[13]、内分泌系统疾病[14]、自身免疫系统疾病[15]、心血管疾病[16]的作用。外泌体参与了各种生理过程，包括细胞的增殖[17]、分化[18]、炎症[19]、老化[20]、血管生成[21]、压力应激和心血管重塑[22]。外泌体参与了心血管病的多个病理生理学过程，并与多个心血管疾病密切相关。MicroRNAs是外泌体起作用的主要成分。而药物通过改变外泌体-microRNAs的表达来起到抗心力衰竭作用的报导却很少。因此，本研究探讨ISMN与压力超负荷所致慢性心力衰竭小鼠血浆外泌体-microRNA378间的关系。本研究采用RT-qPCR测量血浆外泌体-microRNA378的表达水平，结果显示： 与TAC组相比，TAC+ISMN组外泌体-MicroRNA-378表达明显升高(P<0.05)；提示ISMN能上调外泌体-microRNA378的表达。microRNA378是具有心脏保护性的MicroRNA，能抑制心肌细胞肥厚及心肌纤维化，从而改善心功能[23-24]。本研究通过转染microRNA378的类似物和抑制剂来上调和下调microRNA378水平，根据胎儿基因ANP、SAA的表达水平，证实上调microRNA378能抑制心室肥厚，而下调microRNA378后硝酸异山梨酯对心肌的保护作用减弱，提示硝酸异山梨酯可能通过上调外泌体-microRNA378途径起作用。文献[25]报导，MircroRNA423-5p、MircroRNA320a、MircroRNA 22、MircroRNA92b同时升高，诊断慢性心力衰竭可达到灵敏度90%、特异度90%。这甚至更优于经典的诊断慢性心力衰竭的指标NT-proBNP及血清胱抑素C[26]。本研究发现压力超负荷诱导的慢性心力衰竭的小鼠血浆外泌体-microRNA378水平明显下降，提示血浆外泌体-MiCroRNA378下降可能是诊断慢性心力衰竭的一个新的标志物。

综上所述，本研究提出ISMN通过上调外泌体-microRNA378的表达减轻机械牵张诱导的心力衰竭，为ISMN改善慢性心力衰竭患者心功能提供了一个新的作用机制，为压力超负荷诱导的心力衰竭患者临床使用ISMN改善心肌重塑、减轻心力衰竭提供了新的理论依据。本研究发现通过上调microRNA378的表达水平，可以减轻心室重构，改善心功能，为将来心力衰竭的药物治疗提供了一个新的干预靶点。然而microRNA378减轻心室重构，改善心功能的具体机制仍然需要进一步的研究来阐明。