反复丙泊酚麻醉对大鼠学习记忆功能的影响

秦晓菁，张晓庆

(同济大学附属同济医院麻醉科，上海 200065)

丙泊酚(propofol)，是一种起效快，苏醒迅速，持续输注后无蓄积作用的短时效全身麻醉药。临床上，丙泊酚常用以手术前麻醉诱导、术中麻醉维持及术后的ICU镇静。

研究［2］显示，应用较大麻醉剂量的丙泊酚不仅可产生逆行性遗忘，同时也对动物的学习记忆功能有所影响。当腹腔注射低于镇静剂量的丙泊酚后，记忆能力受损［3］，静脉注射镇静剂量的丙泊酚后，损伤老年大鼠的术后认知功能［4］。许继元等［5］的研究显示，注射镇静剂量后，虽影响学习记忆功能，但停药后又迅速消失。因此，对于不同剂量的丙泊酚对大鼠学习记忆功能的影响，及影响的时效性及剂量依赖性仍取决于多方因素的调控，有待更为全面详尽的基础研究。此外，丙泊酚在脑细胞促凋亡及海马突触可塑性改变方面的作用［6］，是学习记忆功能的神经生物基础。

本研究使用Morris水迷宫，对多次注射不同剂量丙泊酚的成年SD大鼠学习记忆功能进行检测，并通过Bax抗体染色进行细胞凋亡反应的测定，同时观测大鼠海马神经元细胞及突触超微结构的变化，探讨不同剂量的丙泊酚连续注射，对成年SD大鼠的学习记忆功能的可能影响及是否存在剂量依赖性。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SPF级7周龄雄性SD大鼠32只，常规饲养1周(实验时为8周龄)，体质量250～270 g。将大鼠随机分为4组，每组8只，分别为:镇静剂量丙泊酚组(Prop 5组)、低剂量丙泊酚组(Prop 20组)、高剂量丙泊酚组(Prop 30组)和10%脂肪乳剂组(Lip组)。

1.2 实验方法

1.2.1 给药方法 丙泊酚的3个剂量组，均采用15 mg/kg的丙泊酚作为诱导剂量。之后，Prop 5组、Prop 20 组和Prop 30 组分别以5、20、30 mg/(kg·h)的剂量维持麻醉2 h;Lip组首先给予15 mg/kg的脂肪乳剂，之后脂肪乳剂维持输注量与Prop 30等毫升数。所有药物经大鼠尾静脉注射，每日给药1次，连续5 d。第6天起，进行行为学实验(定位航行实验及空间探索实验)。

1.2.2 行为学实验方法 开始正式行为学实验前，将大鼠置于Morris水迷宫不含平台的水池中，自由游泳1 min左右，以适应环境，继而行定位航行实验。从离平台最远象限(本实验中即为左上象限)，将大鼠背对平台投入水中，计时120 s。若找到平台(本实验中为右下象限)，让其停留在平台上;若规定时间内未寻找到平台，引导其上平台，停留20 s。大鼠每天训练2次，记录寻找平台的时间，即潜伏期(在规定时间内，未找到平台，按120 s计算)。第10天，行空间探索实验，撤去隐匿平台，按同一入水位置，投入水中，记录60 s内大鼠的游行轨迹、穿越平台的次数及第1次穿越平台的时间。

1.3 石蜡、电镜标本制作

空间探索实验结束当天，每组随机取6只大鼠，用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.35 mg/kg)。开胸后暴露心脏，经左心室灌注生理盐水约100 ml后，制作石蜡标本的大鼠以4%多聚甲醛(pH 7.4)灌注，持续约15 min。制作电子显微镜标本的大鼠灌注4%多聚甲醛－1%戊二醛固定液(pH 7.4)100 ml。大鼠灌流固定后，分别断头取脑，参照大鼠立体定位图谱，取视交叉后5 mm至小脑前的脑组织块。用以制作石蜡标本的组织经乙醇梯度脱水，二甲苯透明后石蜡包埋，用于后期H-E染色和免疫组织化学法染色。用于免疫组织化学法染色的组织，需在取材48 h内制成蜡块。用于制作电子显微镜标本的组织置于蜡板上，剥离海马组织，取4～5粒1 mm3的海马组织块，放入4℃含戊二醛的固定液中，固定至少2 h后备用。

1.4 统计学处理

SPSS 14.0软件处理，行为学数据由Morris水迷宫视频分析系统直接获得，为计量资料，以x±s表示，t检验、单因素方差分析进行显著性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠行为学实验结果

在定位航行实验中，不同剂量的丙泊酚各组，潜伏期均长于Lip组。统计学显示:Prop 5组第2天的潜伏期有统计学意义(P＜0.05)，Prop 20和Prop 30组在第2、3天内的潜伏期明显长于Lip组(P＜0.05)。在同一时间点，随丙泊酚浓度的增加，潜伏期延长(P＜0.05)，见表1。在空间探索实验中，Prop 20组及Prop 30组的穿越平台次数和首次穿越平台时间，差异有统计学意义(P＜0.05);4组组间活动总路程，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2、图1。

表1 大鼠连续4 d定位航行实验潜伏期Tab.1 Latency in place navigate test in four groups(±s)

表1 大鼠连续4 d定位航行实验潜伏期Tab.1 Latency in place navigate test in four groups(±s)

与 Lip组相比，(1)P ＜0.05;丙泊酚三组组内比较，(2)P＜0.05

组别 第1天 第2天 第3天 第4天Lip 组 103.79 ±8.49 48.23 ±4.12 34.75 ±3.62 16.58 ±4.43 Prop 5 组 109.13 ±7.95 76.35 ±5.82(1)54.83 ±6.53(2) 30.17 ±5.48(2)Prop 20 组115.44 ±5.29 85.25 ±4.79(1)60.69 ±4.46(1)(2)33.43 ±6.54(1)(2)Prop 30 组117.58 ±5.58 92.83 ±4.24(1)69.42 ±3.81(1)(2)38.35 ±4.32(1)(2)

表2 大鼠空间探索实验结果Tab.2 Results of spatial probe test in four groups(±s)

表2 大鼠空间探索实验结果Tab.2 Results of spatial probe test in four groups(±s)

与 Lip组相比，(1)P ＜0.05

组别 第1次穿越平台时间/s穿越原平台次数 总路径/mm Lip 组 15.15 ±2.47 3.08 17 821.25 Prop 5 组 18.53 ±2.12 2.45 19 357.13 Prop 20 组 23.29 ±3.57(1) 2.20(1) 20 371.38 Prop 30 组 27.36 ±3.84(1) 1.85(1) 21 167.94

图1 空间探索轨迹图Fig.1 Trajectories of spatial probe tests in four groups

2.2 H-E及免疫组化染色实验结果

观察4组大鼠海马CA1区H-E染色切片，低倍显微镜下，丙泊酚3组海马组织，与Lip组比较，均未见明显差异，各组染色均匀，结构清晰，见图2。使用Bax抗体染色后，Prop 20及Prop 30组，光学显微镜下染色呈现棕黄色颗粒，位于细胞浆内(如箭头所示)，有凋亡细胞颗粒产生。而Lip组和镇静剂量丙泊酚组无凋亡细胞颗粒产生，见图3。

图2 4组海马组织H-E常规病理染色结果Fig.2 Results of H-E staining of cerebral hippocampus in four groups(×40)

2.3 透射电镜实验结果

电子显微镜下观察4组海马组织CA1区超微结构，Lip组海马组织、神经细胞结构无明显变化。Prop 5组，海马神经细胞胞体轻度肿胀，突触前膜囊泡不致密;Prop 20组，胞体肿胀，外缘有分离趋势;Prop 30组，细胞体严重肿胀，并且高倍镜下可见个别神经细胞内有自噬现象(如箭头所示)，见图4。

图3 4组海马组织Bax抗体免疫组织化学法染色结果Fig.3 Immunohistochemical staining of Bax expression in four groups(×40)

图4 四组海马组织CA1区超微结构电镜实验结果Fig.4 Ultrastructural changes of hippocampal CA1 neurons

3 讨 论

海马组织作为大脑边缘系统的主要部分，参与学习与记忆条件反射的形成。既往报道大鼠的学习记忆功能与海马组织有密切关系［6-7］。尤其是海马神经的突触可塑性，被认为是学习记忆的神经生物学基础［8］。突触可塑性与神经系统的发育、损伤后的修复及学习记忆等重要脑功能的完成密切相关，在条件刺激下诱发的突触传递功能的长时程改变，即是长时程增强(long-term potentiation，LTP)，而突触囊泡与突触前膜的融合，是突触传递的基础［9］。

本实验在SD大鼠成年期，每日使用不同剂量的丙泊酚镇静、麻醉，连续5 d。后选用Morris水迷宫行大鼠行为学实验，同时，观察海马组织细胞及突触的超微结构变化。定位航行实验显示，丙泊酚各组潜伏期均长于脂肪乳剂组，Prop 20和Prop 30组在第2天、第3天内的潜伏期明显长于Lip组(P＜0.05)。表明丙泊酚对动物学习记忆功能的影响较明显。本实验中，在同一时间点，随着丙泊酚浓度的增加，潜伏期明显延长(P＜0.05)。脂肪乳剂作为溶剂对照，排除了因溶剂因素可能导致的影响。随着训练天数的增加，脂肪乳剂及丙泊酚各组大鼠的寻找平台潜伏期均逐渐缩短(P＜0.05)，这一现象符合学习记忆的一般规律［10-11］。第4天时，由于经过3 d的训练，强化了记忆，因此各组间差别已不明显。在空间探索实验中，低剂量及高剂量组的穿越平台次数和首次穿越平台时间，差别有统计学意义(P＜0.05)，随着浓度增加，首次穿越时间延长，穿越次数减少。丙泊酚对大鼠的空间记忆功能产生抑制作用，并且呈剂量依赖性。

在细胞凋亡过程中，Bcl基因家族的表达蛋白具有重要作用，其中Bax基因表达的蛋白则具有促凋亡的作用。本实验选用凋亡因子Bax测定实验大鼠海马神经元细胞的凋亡。经Bax抗体染色后，Prop 20组和Prop 30组海马组织有棕黄色凋亡颗粒。而Lip组和Prop 5组没有棕黄色凋亡颗粒。提示镇静剂量的丙泊酚无明显的促细胞凋亡作用，麻醉剂量的丙泊酚则表现为明显的促进海马细胞的凋亡反应，从而对大鼠学习记忆功能产生明显抑制。既往研究［2，4］显示，腹腔单次注射麻醉剂量丙泊酚，导致鼠的学习记忆功能短暂受损;虽镇静剂量的丙泊酚也会影响老鼠学习记忆功能，但停药后1 d即迅速消失。由此可见，镇静剂量下的丙泊酚或单次注射麻醉剂量丙泊酚，对学习记忆功能的损伤是短暂的。本实验中，通过反复多次丙泊酚镇静及麻醉，发现丙泊酚对海马细胞的凋亡反应有促进作用，并随着剂量的增加，损伤更明显，即呈现剂量依赖性。

研究［12］证实海马脑片LTP的形成能被丙泊酚抑制，丙泊酚对海马LTP的抑制作用呈剂量依赖性，其机制可能与影响突触体的谷氨酸、γ-氨基丁酸和5-羟色胺释放有关［13］。国外类似研究［14］采用连续酶标荧光法测定结果表明，丙泊酚呈剂量依赖性地抑制鼠大脑皮层突触体谷氨酸的释放，最终抑制大脑皮层和海马LTP的形成。

本实验通过透射电镜观察到，Lip组海马结超微构无明显异常。而丙泊酚各组的海马神经元结构存在不同程度的改变。Prop 5组神经细胞轻度肿胀，突触前膜囊泡较疏松、不致密;Prop 20组胞体肿胀，细胞外缘有分离的趋势，对受体传导通路可能造成了影响;Prop 30组海马神经元细胞胞体严重肿胀，细胞间分离，突触前膜囊泡疏松，并且高倍镜下可见个别神经细胞内已存在自噬现象。可见，随着丙泊酚剂量的增加，海马神经元细胞及突触的改变愈加明显。

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