粒细胞集落刺激因子对自发性高血压大鼠心室重构的调控

王雪婷，罗 明

(同济大学附属同济医院心内科，上海 200065)

高血压通过压力负荷及一系列神经内分泌因素，引起心室重构，增加心力衰竭的发生风险，尽管近年来对血压的控制率有所提高，心室重构的高血压患者发生心力衰竭事件的仍然较高。粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，GCSF)动员骨髓干细胞，在治疗急性心肌梗死、保护心脏、预防心力衰竭的实验研究方面取得一定进展［1］，本实验以自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)为动物模型，通过早期反复大剂量皮下注射G-CSF动员骨髓干细胞，观察大鼠心脏功能及病理改变，探讨G-CSF对高血压早期心室重构的调控作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组用药

SHR大鼠饲养于海军医学研究所动物房(SPF级)，雄性，体质量 250～300 g，每笼 5只，恒温(24℃ ～25℃)，恒湿(50% ～60%)，自由取食摄水，人工照明，阴暗交替各12 h。

30只SHR大鼠随机分为3组，每组10只。粒细胞集落刺激因子组(G-CSF组):14 d为1个周期，周期内前5 d连续皮下注射G-CSF(杭州九源基因工程有限公司生产)50 μg/(kg·d)，生理盐水稀释成0.5 ml，后9 d不用药物，连续进行4个周期;假性实验组(NS组):14 d为1个周期，周期内前5 d连续皮下注射生理盐水0.5 ml/d，后9 d不用药物，连续进行4个周期;空白对照组(空白组)不给药。每天同一时间(上午9点开始)大鼠皮下注射药物。实验干预期间，每周检测血压、体质量。血压采用无创尾套间接测量法，每次测血压连续测量3次，取平均值。

1.2 超声心动图检查

8周饲养结束，将大鼠用3%戊巴比妥钠以1 ml/kg腹腔注射麻醉，卧位固定，左胸前区剃毛，用频率为17.5 Hz探头对大鼠进行超声检查，测量指标包括室间隔厚度(interventricular septal thickness，IVST)、左室舒张末期内径及左室收缩末期内径，左室短轴缩短率(fractional shortening，FS)由超声仪自动计算输出。各指标均在连续3个心动周期测量后取其平均值。

1.3 病理学检查

1.3.1 组织包埋、脱水、切片、染色 取经乳头肌横断左室心肌组织，标本编号后放入包埋框冲水3 h，然后将包埋框取出置入包埋机进行垂直石蜡包埋，包埋结束后将标本转入脱水机进行自动脱水、组织透明及透钠过程如下:70%乙醇3 h，75%乙醇3 h，80%乙醇3 h，90%乙醇 3 h，95%乙醇 2 h，95%乙醇 2 h，100%乙醇2 h，100%乙醇2 h，二甲苯2 h，二甲苯2 h，石蜡1.5 h，石蜡1.5 h。脱水结束标本切成3 μm厚玻片标本，每块组织各制作玻片标本2张，一张行H-E染色，一张行Masson染色。染色后封片。

1.3.2 取材与固定 干预实验结束后，用3%戊巴比妥钠以1 ml/kg腹腔注射麻醉，解剖大鼠，解剖过程注意观察胸腹各脏器外观有无异常。迅速摘取心脏，去除心房、大血管和心包组织，留取心室，冰生理盐水冲洗干净，清洁滤纸吸干水分用电子天平称心室湿重，组织用4%多聚甲醛溶液固定。

1.3.3 图像分析 图像于光学显微镜下观察拍照，照片采用计算机辅助图像分析系统Image-Pro Plus 6.0进行分析。在H-E染色下，观察左心室心肌的基本病理变化。在Masson染色下左心室心肌标本测定心肌胶原容积分数(collagen volume fraction，CVF)和血管周围胶原面积(perivascular collagen area，PVCA)。切片上随机选取10个视野，通过灰度调节区别胶原和非胶原成分，胶原容积分数为胶原面积与心肌面积的比值，取平均值，其中胶原面积不包括血管周围胶原面积。血管周围胶原面积为每一个标本测量5支呈横切面壁内小动脉的周围胶原面积与血管腔面积的比值，取平均值。

1.4 统计学处理

全部数据采用SPSS 19.0统计软件包分析，实验结果以x±s表示。3组统计采用单因素方差分析(ANOVA，LSD)。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 体质量及血压指标

干预前各组SHR大鼠体质量、收缩压及舒张压指标差异无统计学意义(P＞0.5)。8周干预后各组SHR大鼠体质量、收缩压及舒张压指标差异无统计学意义(P＞0.5)，见表1。

表1 干预前、后各组体质量、收缩压、舒张压比较Tab.1 Comparison of body weight，systolic blood pressure，diastolic blood pressure before and after intervention(±s)

1 mmHg=0.133 kPa

BW/g SBP/mmHg DBP/mmHg组别干预前 干预后 干预前 干预后 干预前 干预后G-CSF组 282±13 377±10 186±4 198±5 144±5 153±4 NS组 282±11 384±12 184±6 200±5 142±4 154±5空白组279±11 383±14 185±6 199±6 141±3 155±5

2.2 心室质量/体质量、心超室间隔厚度、左室短轴缩短率比较

实验干预8周后，解剖结果显示，G-CSF组较NS组及空白组心室质量/体质量比值(VW/BW)增加差异有统计学意义(P＜0.01);心脏彩超显示GCSF组较NS组及空白组IVST增加(P＜0.05)，FS增加(P＜0.05)，提示G-CSF促进自发性高血压大鼠心室肥厚，增强心肌收缩力，维持心脏功能。NS组与空白组相比，VW/BW、IVST、FS差异均无统计学意义(P＞0.05)，提示生理盐水皮下注射刺激对大鼠心室结构改变及功能无明显影响，见表2。

表2 心室质量/体质量比值、心超室间隔厚度、左室短轴缩短率Tab.2 Ventricular weight/body weight，interventricular septal thickness，fractional shortening in 3 groups(±s)

表2 心室质量/体质量比值、心超室间隔厚度、左室短轴缩短率Tab.2 Ventricular weight/body weight，interventricular septal thickness，fractional shortening in 3 groups(±s)

与 G-CSF 组相比，(1)P ＜0.05，(2)P ＜0.01

组别 (VW/BW)/‰ IVST/mm FS G-CSF 组 4.34 ±0.16 3.01 ±0.10 61.86 ±5.63 NS 组 4.06 ±0.18(2) 2.88 ±0.11(1) 49.16 ±5.32(2)空白组 4.10 ±0.20(2) 2.84 ±0.13(1) 49.51 ±5.23(2)

2.3 H-E 染色

心肌组织的H-E染色显示，G-CSF组心肌纤维较NS组及空白组致密，排列相对整齐;NS组与空白对照组较为接近，心肌纤维排列紊乱，部分甚至断裂，见图1。此结果与解剖及心超结果一致，提示GCSF促进自发性高血压大鼠心肌良性肥厚，对抗后负荷。

图1 大鼠心肌H-E染色Fig.1 Rat myocardial H-E staining(×100)

2.4 Masson 染色

光镜下可见心肌细胞核呈蓝褐色，胞浆呈红色，胶原纤维呈蓝色。NS组及空白组SHR心肌细胞间及血管壁周围可见大量胶原纤维增生，较G-CSF组明显增加，见图2。NS组与空白组间心肌CVF和PVCA差异无统计学意义(P＞0.05)，G-CSF组与另2组相比CVF、PVCA明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表3。提示G-CSF改善心肌纤维化。

图2 大鼠心肌Masson染色Fig.2 Rat myocardial Masson staining(×100)

表3 心肌CVF和PVCA变化Tab.3 Changes of collagen volume fraction and perivascular collagen area (±s)

表3 心肌CVF和PVCA变化Tab.3 Changes of collagen volume fraction and perivascular collagen area (±s)

与对照组相比，(1)P ＜0.01

组别 例数CVF/% PVCA/%G-CSF 组 10 4.82 ±0.55(1) 0.85 ±0.12(1)NS 组 10 6.26 ±0.54 1.17 ±0.10空白组 10 6.12 ±0.53 1.14 ±0.15

3 讨 论

3.1 改善高血压左室及血管重构的意义

心脏重构是高血压最重要的靶器官损害，心脏的重构主要表现为心肌肥厚缺血缺氧与心肌间质纤维化，而心肌间质纤维化在心力衰竭的发生过程中更为重要，欧洲高血压协会(European Society of Hypertension，ESH)指南中指出，高血压患者心血管系统总体风险评估，不仅取决于血压水平，还取决于是否存在临床或亚临床靶器官损害，亚临床靶器官损害是高血压患者预后的独立预测因子［2］。对高血压导致的靶器官损害进行早期诊断，有针对性地尽早治疗，逆转或延缓损伤，具有决定性意义。

3.2 高血压心血管重构的机制

高血压通过影响机体内皮功能、肾素血管紧张素系统、炎症反应、细胞内钙超载等，造成心血管重构［3］，血压的升高是高血压心血管重构的始动因素，由于后负荷的增加，心肌代偿肥大，以满足周围循环的灌注，但是肥大的心肌克服阻力做功较多，相对容易缺血缺氧，心肌细胞往往排列紊乱，而原发性高血压本身内皮功能受损，细胞凋亡加速，心肌及周围毛细血管减少，肥厚的心肌更加缺血缺氧，乳酸堆积，由于毛细血管的减少，不利于心肌代谢不良产物排出，加之高血压神经体液内环境的紊乱，心肌周围胶原更容易发生纤维化，造成室壁运动僵硬，顺应性减低，心脏收缩力减弱，以致周围灌注不足，而循环灌注的损伤更加重了内环境的失调，在持续的后负荷作用下，缺血缺氧且活动度差的心肌排列更加紊乱，甚至出现断裂，失代偿的心室壁菲薄，呈现心力衰竭。

3.3 G-CSF调节高血压心血管重构的机制

G-CSF通过心肌表面受体G-CSFR发挥直接保护作用，抑制心肌缺血再灌注损伤［4］，G-CSF还可通过干扰SDF-1与其受体CXCR4结合，动员骨髓干细胞致外周血，G-CSF动员的CD34+细胞包含未成熟及成熟的内皮及心肌先祖细胞，体外培养证实可分化为内皮细胞及心肌细胞，动物和临床实验直接输入心肌，可参与心肌损伤再生修复，减弱梗死导致的电传导减慢，减小梗死瘢痕面积，提高梗死区周围灌注，增加毛细血管密度，增加梗死区心室壁厚度，阻止胶原沉积，保留心室几何结构，减弱电生理重构，减少心律失常发生可能，提高左室射血分数，延缓心衰［5］。

3.4 G-CSF调控高血压心血管重构的有效性

在大量心肌梗死动物模型中已经证实，连续5 d皮下注射G-CSF 50 g/(kg·d)可有效动员大鼠骨髓干细胞，促进毛细血管生成，减少心肌纤维化，改善心脏射血分数及远期预后，本实验将G-CSF在心肌梗死过程中表现出的保护作用，转化至高血压模型中观察，由于高血压心血管重构自然病程较长，进展缓慢，考虑一次或短期的用药可能不足以产生有益效果，且G-CSF对于SDF-1/CXCR4信号轴的激活以动员骨髓干细胞，在开始用药后14 d达到峰值，21 d时作用已经明显减弱［6］，本实验创新性设计通过8周内连续4个周期，每个周期前5 d连续50 g/(kg·d)皮下注射G-CSF，反复动员骨髓干细胞。考虑等已进展至心力衰竭再应用G-CSF，收益可能减小，本实验选取10周龄SHR大鼠，在心血管重构早期反复给予大剂量G-CSF动员骨髓干细胞，以观察其对自发性高血压大鼠心血管重构的作用。

实验结果显示，应用G-CSF大鼠心脏较对照组肥厚，左室短轴收缩率提高，心肌收缩力增强，心脏纤维化减少。与传统意义上改善心脏重构理解不同的是，G-CSF不是减轻心脏肥厚，而是增加了心室质量/体质量比值及室间隔厚度，众所周知高血压心室肥厚是预后的不良因素，分析肥厚的心肌造成预后不良的原因，是由于肥厚的心肌缺血缺氧，加之心肌间质纤维化的束缚，顺应性下降，容易发生失代偿进而心力衰竭，而如前所述G-CSF动员骨髓干细胞可增加心肌修复，促进毛细血管生成，改善供血，并且减少纤维化，而纤维化才是造成室壁活动僵硬舒张减退的更重要的引起心力衰竭的因子，因此可以理解为自发性高血压大鼠接受G-CSF动员骨髓干细胞后，心肌在压力负荷下代偿性良性增生肥厚，且结合病理学结果，G-CSF组心肌细胞排列较整齐，而NS组及对照组心肌排列紊乱，甚至部分出现断裂，更进一步的心超结果也证实了G-CSF组肥厚心肌功能较对照组好，左室短轴收缩率提高，心肌收缩力增强，与大样本高血压患者横断面研究中显示高血压肥厚性重构与收缩及舒张功能减退及心室内压力增高相关不同［7］，G-CSF组并没有表现出疾病过度进展出现的肥厚心肌运动力差、收缩及舒张功能减退的情况，而心肌收缩及舒张功能的减退，必然导致周围灌注不足，加重内环境的紊乱，反过来加重心衰。

心脏在压力、容量负荷及损伤等情况下，为维持心脏功能，代偿出现适应性肥厚，生理性肥厚表现为正常的心脏形态与加强的心脏功能，而病理性肥厚表现为间质纤维化、细胞死亡的增多及心脏功能的丧失［8］。与运动体育训练出现的心脏肥厚相似，GCSF介导的心肌肥厚，没有证据提示加速疾病进展，且伴随心肌毛细血管增加，血供改善，心肌收缩力增强，心脏纤维化减少，室壁活动度改善，潜在改善舒张功能，是适应性良性肥厚，这种肥厚能否成为一种额外储备延缓远期心力衰竭尚待进一步研究。此外，由于血压的升高才是心脏及血管重构纤维化的始动因素，本实验对血压并未控制，采取自然状态，可以推测，良好的控制血压条件下，心肌不需要克服巨大的后负荷阻力，早期反复大剂量G-CSF诱导骨髓干细胞对于心脏的保护作用，可能存在更良好的受益。

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