蛋白质组学策略助力中药现代化的研究进展*

贾国香，董亚倩，杨娜，钱文秀，殷宏庆，杨珅珅，李遇伯

（天津中医药大学中药学院，天津 301617）

中药是中国医药科学的特色，也是中华民族传统文化的重要组成部分，至今在中国的医疗保健活动中发挥着不可替代的作用[1]。中药现代化是指以继承和发扬传统中医药的优势和特色为基础，利用现代先进科学技术，依照国际通行的标准规范，研究出高效、安全、稳定、质量可控的现代中药产品[2]。然而，目前中国中药现代化的研究进展仍比较缓慢，主要是因为以下3个关键性因素：1）大多数中药作用机制的研究方法背离了中医药的核心思想，割裂了中药众多成分之间的有机联系，不能体现出中药多组分、多靶点协同作用的特色[3]。2）中草药的生长环境、栽培方法、采收时期、加工工艺等诸多因素造成了其成分含量的差异性，进而难以保证中药产品的质量稳定性，使得中药质量标准规范仍不完全符合国际标准和市场要求[2]。3）关于中药安全性的基础研究较少，尤其是缺少对中药产生不良反应的活性成分及机制的深入探索，导致中药安全性评价体系不够完善[4]。随着生命科学的研究进入了后基因组时代，以蛋白质组学等多种组学为基础的系统生物学已成为研究中药现代化的重要工具。蛋白质组学采取全方位的、系统的研究模式，通过其高灵敏度、高通量、高效率的技术手段，从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成与活动规律，其研究思路与中药整体性、动态性和系统性的作用特点相契合。因此，利用蛋白质组学技术，通过分析蛋白质组表达谱的差异，不仅可以揭示中药多环节、多靶点、多组分的分子机制，还对于控制中药质量、优选种质资源及完善现代中药安全性评价体系具有重要的指导意义。总之，借助于蛋白质组学较为完善的理论与技术，充分发挥中药的独特优势，已经成为当前中药现代化研究的重点。下文将详细介绍蛋白质组学相关技术概况及其在中药现代化研究中的应用。

1 蛋白质组学概况

蛋白质组学的概念是1994年由澳大利亚麦考瑞大学的Wilkins等首次提出的[5]，其目的是通过各种技术手段对蛋白质在生物体内的表达进行多层次评估，从而更加熟悉复杂的生理病理过程[6]。根据蛋白质组学研究技术的原理，可以分为化学蛋白质组学、差异蛋白质组学和定量蛋白质组学[7]，具体分类见图1。从研究策略的角度来看，可以将其分为经典蛋白质组学策略（基于双向凝胶电泳-质谱技术）和鸟枪法蛋白质组学策略（基于二维液相色谱-串联质谱技术）[8]。近年来，蛋白质组学技术在植物信息的获知、疾病机制的阐释、药物的筛选和新药的研发等方面得到了广泛的应用。在植物方面，蛋白质组学的应用丰富了植物在蛋白质水平上的知识，包括蛋白质组中所有蛋白质的组成及其相互作用等，有助于理解植物功能的基本原理[9]。在疾病方面，该技术对阐明肾病、肿瘤、糖尿病、心血管疾病和呼吸系统疾病的发病机制、病程进展、疾病分型具有重要意义[10-16]。在药物方面，蛋白质组学的应用为药物有效成分的筛选以及中药新药的研发提供了新思路[17-18]。目前越来越多科研工作者着眼于蛋白质组学技术在中药现代化中的应用。

图1 蛋白质组学常用技术分类

2 蛋白质组学在中药中的研究进展

迄今为止，众多研究人员在系统生物学的指导下开展了中药复杂体系的多角度、多层次、多水平研究。其中，蛋白质组学正逐渐成为一种有效的新策略驱动中药现代化进程，包括立足于该技术侧重的整体性和动态性，提升中药材的药用价值，发现中药新靶点和信号通路，阐明中药作用机制和毒性机制、完善中药的安全性评价体系等，具体见图2。

图2 蛋白质组学在中药研究中的应用

2.1 基于中药植物学的研究进展 利用蛋白质组学对中药材中与光合作用、能量、代谢等相关的蛋白质进行研究，不仅可以获取中药材在生长、发育、成熟和衰老过程中蛋白质的变化规律，还为中药材中有效成分的定向生物合成提供了理论依据。目前，蛋白质组学技术已被用于中药植物学的研究中，以人参、块茎旱金莲、木薯、太子参为例，分别从其自身疾病、加工方法、发育时期、产地方面进行阐述。红皮病是人参的一种非传染性疾病，主要是由于人参中的金属元素（如铁、铝）显著增加引起的。Ma等[19]通过双向电泳技术（2-DE）以及同位素标记相对和绝对定量技术（iTRAQ）分析了红皮病人参和健康人参蛋白质组学的变化。与健康人参相比，在红皮病人参中共鉴定出137种差异蛋白，其中大多数差异蛋白与碳和氮代谢、氧化还原稳态及抗逆性有关。除此之外，红皮病影响了营养物质（糖、蛋白质、氨基酸等）和活性成分人参皂苷的生物合成。该研究有助于阐明人参红皮病的发病机制，从而提高人参的存活率和药用价值。Aguilar等[20]在蛋白质组学水平上比较了不同方法加工的块茎旱金莲中蛋白质的丰度差异，与其他加工方法（阴干、冷藏或阴干结合日晒）相比，长时间暴露于阳光下能显著增加块茎旱金莲中蛋白质（如热休克蛋白）丰度，还可以促发其适应机制，提高渗透调节能力和抗氧化能力，从而证实日晒后块茎旱金莲的药用价值更高。Ding等[21]应用转录组学、蛋白质组学和代谢组学等多组学联合研究木薯块根在不同发育时期中淀粉含量的变化，在发育早期的转录组和蛋白质组水平上，许多参与蔗糖降解和淀粉生物合成的基因均高度表达，而参与淀粉降解的4个必需基因显示出相反的表达模式。此外，蔗糖-淀粉途径中涉及的3种关键代谢物也相应改变。以上结果表明，淀粉的生物合成主要在发育的早期被激活，但在后期受到较大限制，为木薯中淀粉的定向生物合成提供了依据。Hua等[22]运用转录组学、蛋白质组学和代谢组学比较了人工栽培太子参与野生太子参之间的差异，与野生太子参相比，人工栽培太子参中的碳水化合物代谢和细胞氨基酸代谢显著降低，但其对胁迫的响应能力增强。代谢组学结果进一步显示，7种重要的差异蛋白可以调控野生太子参和人工栽培太子参中蔗糖和氨基酸的代谢，这将有助于探究不同生态型间次生代谢产物差异的根本原因。此外，蛋白质组学还可以用于冬虫夏草品种的鉴定[23-24]。借助于蛋白质组学用以鉴定中药材的真伪优劣、指导中药有效物质的生物合成及阐明中药应答胁迫的分子机制等，其在中药植物学的现代化研究中发挥重要作用。

2.2 基于中药药性的研究进展 中药药性包括四气、五味、归经等，其中四气（寒、热、温、凉）是中医药属性理论的研究热点[25]。近年来，蛋白质组学技术多用于寒凉中药及温热中药的新陈代谢和药效物质基础研究。王秋红等[26]用温热中药（花椒、干姜、附子）灌胃正常大鼠后，应用蛋白质组学技术鉴定大鼠肝脏中的差异蛋白，共筛选出50个共有差异蛋白。iTRAQ蛋白质组学结果表明，3种温热中药在影响机体新陈代谢中存在共性，主要通过调控代谢相关蛋白的表达来增强机体的能量代谢和物质代谢。现代药理学研究证明了三者在药理作用中也存在共性。该研究还探讨了3种温热中药在蛋白质组学方面存在的差异性，为阐释中药药性的理论内涵提供了依据。杨欣[27]采用二维液相色谱-串联质谱（2D-LC-MS/MS）技术鉴定灌胃寒凉中药（黄连、黄柏、黄芩）的大鼠组织中的差异蛋白，共筛选出85个差异蛋白。进一步通路富集分析后发现差异蛋白主要通过参与脂肪酸生物合成、淀粉和蔗糖代谢、三羧酸循环等途径减少机体能量生成和利用，导致机体能量代谢紊乱，从而明确了寒凉中药对能量代谢的影响。王厚伟等[28]采用蛋白质印迹法和全电性离子色谱法分别筛选出温热中药（仙茅、干姜、肉桂）和寒凉中药（金银花、黄连、知母）的药性标识峰，并对药性标识峰进行共有蛋白条带分析。蛋白质印迹法分析表明，温热中药的3条共有蛋白条带和寒凉中药的2条共有蛋白条带，可以用于以上6味中药药性的蛋白质分子标记，为中药药性物质基础的研究开辟出一条新途径。李毅等[29]利用双向凝胶电泳（2-DE）技术和质谱（MS）技术研究寒证模型大鼠及温热中药治疗后模型大鼠的肝线粒体蛋白组，结果显示寒证大鼠的能量代谢较弱，表现为线粒体内脂肪酸的β-氧化受阻和蛋白质的合成减少等，而温热中药主要通过增强脂质代谢和增加蛋白质的合成来提高能量代谢水平，以改善寒证症状。该研究进一步明确了中医寒证能量代谢紊乱的物质基础并阐明了温热药的作用机制。此外，张杰等[30]总结并分析中药归经理论的研究现状后，认为蛋白质组学可以作为研究中药归经理论的新方法。蛋白质组学技术不仅有助于阐释中药药性的物质基础，还为中药药效的现代化研究提供了依据。中药药性的整体性、动态性、复杂性等特点，与蛋白质组学的研究特征高度契合，因此蛋白质组学在中药药性的现代化研究中具有突出的优势。

2.3 基于方剂配伍的研究进展 近年来，许多研究者应用蛋白质组学技术寻找与中药方剂调控疾病相关的蛋白靶点和通路，试图从分子水平揭示中药方剂干预疾病的作用机制。许凯霞等[31]以SPF级ICR小鼠早期胚胎为研究对象，通过应用iTRAQ技术对培养液中的差异蛋白进行鉴定与分析，发现左归丸含药血清可通过调节培养液中的相关蛋白通路来保护胚胎发育并改善糖耐量减低等。丁赛丹等[32]应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF-MS）与2-DE技术研究并分析下瘀血汤对肝硬化大鼠模型的干预作用，蛋白质组学结果表明，肝组织中抗氧化应激蛋白表达量的增加可能是其治疗肝硬化的主要机制。Chen等[33]应用无标记蛋白质组学分析大黄蛰虫丸对大肠癌转移的抑制作用，结果表明，大黄蛰虫丸通过减弱CC趋化因子配体2介导的巨噬细胞极化和改善促纤维化微环境来抑制大肠癌的转移。蔡碧莲等[34]运用蛋白质组学技术探讨肝纤维化综合征及其作用机制，通过分析与证候形成相关的蛋白质组特征，优选出治疗肝纤维化及其他肝病的方药。此外，蛋白质组学还有助于阐明中药方剂治疗心力衰竭、炎症、类风湿关节炎、呼吸系统疾病的分子机制[35-38]。将蛋白质组学技术运用于中药方剂研究，有利于阐明中药方剂的作用机制、优化中药方剂的配伍等，对中药方剂的现代化研究具有重要意义。

2.4 基于中药作用靶点及机制的研究进展 蛋白质组学的应用为寻找中药作用靶标以及阐明中药作用机制提供了切实有效的工具。Liao等[39]利用化学蛋白质组学技术检测出半胱氨酸残基140（Cys140）是选择性抑制肌苷一磷酸脱氢酶2（IMPDH2）的共价变构调控位点。苏木的活性成分苏木酮是以Cys140为靶点的小分子化合物，通过诱导变构效应，抑制IMPDH2活性，从而产生抗炎和免疫抑制作用，这对开发苏木治疗神经炎症性疾病的新靶点具有重要意义。

目前该技术已被广泛用于探讨中药复方、单味中药及中药单体化合物对疾病干预的作用机制。Liu等[40]应用比较蛋白质组学、脱氧核糖核酸（DNA）微阵列分析等方法研究脑心通胶囊对脑缺血模型大鼠大脑皮层的影响，结果显示共鉴定出12种差异表达蛋白和27种差异表达基因，可作为脑心通胶囊治疗脑缺血损伤的潜在生物标志物。通路富集分析结果进一步表明，作为MAPK信号通路中的核心转录因子，转录激活因子4（ATF4）和原癌基因（MYC）在脑心通胶囊治疗脑缺血损伤中发挥着关键作用。Zhao等[41]通过整合转录组学、蛋白质组学等多组学数据，分析补肺健脾方治疗慢性阻塞性肺病的作用机制，结果表明补肺健脾方可能通过调节脂质代谢、细胞连接途径、氧化应激和炎症反应等生物学功能来治疗慢性阻塞性肺病。Hua等[42]结合代谢组学和蛋白质组学两种组学技术检测了对照组、血虚模型组、低剂量当归组、中剂量当归组和高剂量当归组肝脏中蛋白质和代谢物的变化，共鉴定出9种差异表达蛋白和13种内源代谢产物，从而确定了4种导致血虚的代谢途径，结果表明，当归主要通过提高造血活性、抑制活性氧产生、调节能量代谢以及促进抗凋亡作用来改善血虚模型小鼠症状，这可能是当归补血作用的潜在机制。Hou等[43]采用串联质谱标记（TMT）肽标记结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术探讨青蒿素的半合成衍生物双氢青蒿素（DHA）的抗肝癌机制，与索拉非尼相比，DHA能显著增强抗肝癌作用，而两者联合使用疗效更佳。该研究有助于阐明中药单体化合物DHA抗肝癌的机制，即上调APOA1蛋白的表达以及下调GALNT10蛋白的表达，APOA1可以抑制肿瘤血管形成以防止肿瘤扩散，GALNT10则是通过修饰O-糖基化和激活PI3K/AKT信号通路来治疗肝癌。此外，蛋白质组学技术的应用也有利于阐明中药治疗心力衰竭、抑郁症以及阿尔茨海默症的作用机制[44-46]。利用蛋白质组学开展对中药作用靶点及其作用机制的研究，不仅为中药新的治疗靶点提供了新线索，还更加全面地阐述了中药治疗疾病的作用机制，推动了中药的现代化进程。

2.5 基于中药安全性的研究进展 近年来，科研人员将不同的蛋白质组学技术应用于中药的安全性研究，通过筛选相关差异蛋白、富集靶蛋白和相关信号通路，从而试图阐明中药的毒理学机制，保证临床用药的安全、稳定、有效及质量可控。Lin等[47]给予大鼠口服不同何首乌提取物（总提取物、水提取物、30%乙醇提取物、70%乙醇提取物和双黄连提取物）90 d后，各组大鼠均出现明显的肝损伤，证实不同何首乌提取物均具有肝毒性作用。iTRAQ定量蛋白质组学研究进一步表明，与线粒体功能相关的氧化磷酸化途径异常是何首乌致肝毒性的主要原因，且NADH脱氢酶和Slc16a2蛋白可能是何首乌致肝毒性的潜在生物标志物。Lin等[48]以L02细胞为模型，应用定量蛋白质组学研究大黄素诱导肝毒性的机制，通过蛋白质印迹法验证、功能富集分析和通路富集分析，共筛选出662种差异蛋白，发现大黄素主要通过抑制线粒体呼吸链复合体的功能，导致氧化磷酸化途径异常，进而诱导肝细胞凋亡。此外，研究人员还应用蛋白质组学阐明了柴胡和补骨脂诱导肝毒性的可能机制，柴胡主要通过影响脂质和蛋白质代谢及氧化应激反应来诱导肝毒性[49]，而补骨脂的肝毒性主要与胆汁酸代谢紊乱有关[50]。Xu等[51]运用LC-MS/MS技术与iTRAQ技术研究半夏诱导胚胎神经毒性的机制，结果显示经半夏处理的小鼠胚胎样品中有153个蛋白质丰度具有显著差异，其中37种差异蛋白的功能与神经系统发育相关，包括大脑发育和神经元发育。上述结果有助于揭示半夏诱导胎儿神经异常的潜在机制。雷公藤甲素是雷公藤的主要活性成分，在治疗自身免疫性疾病方面具有很大的潜力，然而雷公藤甲素具有严重的肾毒性。Xie等[52]通过整合蛋白质组学和代谢组学数据鉴定与雷公藤甲素诱导肾毒性相关的蛋白质和小分子代谢物，共筛选357个与肾损伤有关的差异蛋白和9种相关的代谢产物，进一步富集分析显示，所涉及的代谢途径包括嘌呤和嘧啶代谢、甘油磷脂代谢、鞘脂代谢和氨基酸代谢。雷公藤甲素主要通过诱导上述代谢途径的异常，引起参与相关代谢途径的蛋白质表达量和代谢物含量的变化，从而造成肾损伤。Peng等[53]采用流式细胞仪、蛋白质印迹法和生物信息学分析等方法研究了乌头碱对H9c2大鼠心肌细胞炎症和凋亡的影响。乌头碱主要通过诱导促凋亡因子肿瘤坏死因子-α高表达及激活核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体，导致大鼠心肌损伤和凋亡。体外细胞实验进一步表明，抑制肿瘤坏死因子-α和增强B淋巴细胞瘤-2基因/腺病毒E1B相互作用蛋白3（BNIP3）介导的线粒体自噬，可以有效地逆转乌头碱诱导的心脏毒性。以上发现为阐明乌头碱诱导心脏毒性的分子机制提供了新的见解，并为避免乌头碱引起的心肌损伤提供了新的用药策略。蛋白质组学在中药毒理学中的应用，不仅有利于阐明中药毒性的作用机制，还对科学合理地使用有毒中药具有重要的指导意义，促进了中药安全性的现代化发展。

3 蛋白质组学在中药研究中的应用前景

综上，蛋白质组学技术目前已应用于中药现代化进程中的多个领域研究，借助该技术用以提升中药材的药用价值，揭示药性的现代科学内涵，证实方剂配伍的合理性，阐明中药的作用机制和毒性机制等。除此之外，该技术还可以用于中药有效成分的筛选以及中药新药的研究和开发[15]。随着中药蛋白质组学的理论和技术日益完善，开展中药的蛋白质组学研究还能进一步从分子水平阐明中药不同于西药的多环节、多层次、多靶点的作用机制，为中药的现代化研究提供理论支持[54]。此外，蛋白质组学技术对动物中药中蛋白质、多肽类成分的鉴定与分析也有重要的生物学意义，推动了动物中药的现代化发展[55-56]。

目前，蛋白质组学已在中医药学与现代生命科学之间架起了一座坚实的桥梁，极大地促进了中医药的质量评价和标准化，推动了中医药现代化和国际化的发展进程。然而，蛋白质组学在中药方面的研究仍存在一定的局限性。一方面，研究者缺乏对蛋白质组学数据中各靶点蛋白之间网络关联的认识，无法从分子水平上明确地阐述中药不同成分的协同作用，从而不能更精确地阐述中药的作用机制。另一方面，与基因组学和转录组学数据相比，蛋白质组学技术鉴定的蛋白质相对较少，而且蛋白质组学的结果往往是不统一的[57-58]，这意味着蛋白质组学数据的可靠性较差。因此，在注重蛋白质组学基础研究的同时，更应该注重多组学联合技术应用的研究，为进行更深入的中药蛋白质组学研究奠定基础。随着系统生物学的发展和完善，蛋白质组学技术将会为中药现代化研究的更多方向提供分子水平上的理论依据。