补骨脂酚对小鼠肝功能和胆汁酸转运体BSEP、NTCP的影响*

毕亚男，李　震，周　昆，赵雪言，史　红，郑　林

（1.天津中医药大学中医药研究院，方剂学教育部重点实验室，天津300193；2.天津中医药大学第一附属医院，天津300193）

·实验研究·

补骨脂酚对小鼠肝功能和胆汁酸转运体BSEP、NTCP的影响*

毕亚男1，李震2，周昆1，赵雪言1，史红1，郑林1

（1.天津中医药大学中医药研究院，方剂学教育部重点实验室，天津300193；2.天津中医药大学第一附属医院，天津300193）

［目的］观察补骨脂酚对小鼠肝功能和胆汁酸转运体胆盐输出泵（BSEP）、钠牛磺酸胆酸共转移蛋白（NTCP）的影响。［方法］小鼠连续14 d皮下注射50 mg/kg补骨脂酚和10 mg/kg α-雌二醇，分别在给药1、3、7、14 d后处死部分小鼠取材，检测血清生化，剖取肝脏称质量并进行肝脏病理组织学检查，取新鲜肝脏用酶联免疫吸附法（ELISA法）检测BSEP、NTCP的蛋白表达。［结果］补骨脂酚和α-雌二醇对小鼠体质量没有明显影响。α-雌二醇皮下注射14 d会使小鼠血清谷丙转氨酶（ALP）升高、肝脏肿大、肝系数升高，而补骨脂酚无此作用，但给药期间补骨脂酚可导致血清ALP一过性降低，14 d时恢复正常。补骨脂酚对肝脏BSEP基本没有影响，而会导致NTCP逐渐升高，给药14 d时NTCP显著高于溶剂组。给药14 d，补骨脂酚组小鼠肝脏无病变，而α-雌二醇组小鼠肝脏存在肝细胞变性。［结论］50 mg/kg补骨脂酚给药14 d未见肝脏毒性，而10 mg/kg α-雌二醇肝毒性明显。

补骨脂酚；小鼠；胆盐输出泵；钠牛磺酸胆酸共转移蛋白

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2015.04.08

补骨脂酚是补骨脂中含量最高的成分，属于单萜酚类成分在药材中含量为1.12%～5.149%［1-2］，占挥发油的60%以上［3］，远大于补骨脂素和异补骨脂素0.4%的含量水平［4-5］。有研究发现补骨脂酚对KH-2细胞有显著毒性［6］，而课题组前期研究也表明补骨脂酚对HepG2细胞也有明显毒性，自2005年开始有多起报道补骨脂引起的肝损害［7-9］，实验室有结果显示补骨脂对肝脏会造成损伤［10-13］，那么补骨脂酚是否会与补骨脂的肝毒性有关，报道中补骨脂引起的肝损害多有胆汁淤积的表现，可能与其影响了胆汁酸的转运有关，这与雌激素引起的肝损害很相似［14］。本研究在ICR小鼠连续皮下注射给予观察补骨脂酚对小鼠肝功能和肝脏中胆盐输出泵（BSEP，ABCB11）、钠牛磺酸胆酸共转移蛋白（NTCP，SLC10A1）表达的影响，并设了α-雌二醇作为阳性对照，初步考察补骨脂酚的毒性及其对胆汁酸转运体是否有影响。

1　材料

1.1受试药补骨脂酚，经高效液相色谱法（HPLC）检测纯度＞95%，购自天津月牙湖科技有限公司。

1.2细胞ICR小鼠，雌雄各半，体质量18～22 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（京）2009-0004。

1.3试剂与仪器α-雌二醇（TCI），谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、胆汁酸（TBA）全自动生化仪检测试剂盒（Biosino），BCA蛋白测定试剂盒（Beyotime），BSEP和NTCP试剂盒（Cusabio），1，2丙二醇（天津市江天化学技术有限公司），生理盐水（辰欣药业）。

Legend Micro17离心机为Thermo公司产品，7020全自动生化仪为日立公司产品，脱水切片机均为Lecia公司产品，光学显微镜为Olympus产品，InfiniteM200多功能酶标仪为Tecan公司产品。

2　方法

2.1动物分组及给药100只小鼠，按随机数字表法随机分为4组，即对照组10只、溶剂组40只，补骨脂酚50 mg/kg组40只，α-雌二醇10 mg/kg组10只。参照文献中雌二醇的给药方式［14］，补骨脂酚和α-雌二醇在实验前用溶剂（80%的1，2丙二醇生理盐水液）进行溶解后供皮下注射使用。各组每日按5 mL/kg皮下注射给药1次，对照组以饮用水灌胃，连续14 d。

2.2小鼠肝功能、病理组织学及BSEP和NTCP的检测分别在1、3、7 d给药结束，各取溶剂组和补骨脂酚组小鼠各10只进行实验，剩余小鼠在给药14 d后进行实验。实验前小鼠禁食不禁水12 h，自眼眶取血，3 000 r/min离心分离血清，检测血清中ALT、AST、ALP、TBA。取相同部位肝脏一叶，用12%甲醛液固定，常规石蜡包埋、苏木精-伊红染色（HE），光镜下进行病理组织学检查。取新鲜肝脏用磷酸盐缓冲溶液（PBS）制备肝匀浆并检测总蛋白浓度，将肝匀浆稀释适当倍数，参照酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒说明书，检测小鼠肝脏中BSEP、NTCP蛋白浓度。

2.3统计学处理SPSS 18.0统计软件进行数据处理，实验数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

3　结果

3.1补骨脂酚皮下注射不同时间对小鼠体质量及肝脏的影响补骨脂酚和α-雌二醇连续给药对小鼠体质量没有明显的影响，补骨脂酚和α-雌二醇连续给药14 d小鼠体质量与溶剂组均无统计学差异，见表1。连续给药14 d，补骨脂酚对小鼠肝系数并无显著影响，而α-雌二醇组小鼠肝系数显著高于对照组（P＜0.05），见图1。

表1　给药不同时间小鼠体质量的变化（±s）g

表1　给药不同时间小鼠体质量的变化（±s）g

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图1　给药14 d小鼠肝系数

补骨脂酚50 mg/kg连续给药期间，小鼠血清中ALP有一过性降低，在给药3 d和7 d均显著低于溶剂组，14 d补骨脂酚组小鼠ALP与溶剂组并无统计学差异，而α-雌二醇10 mg/kg连续给药14 d，可使小鼠血清ALP显著升高。血清中AST、ALT和TBA的变化并不显著，见表2-5。

连续给药14 d，对照组小鼠肝细胞排列整齐，肝索清晰，肝细胞无变性坏死。溶剂组小鼠肝脏无明显病理变化。补骨脂酚组小鼠肝脏肝索清晰，未见明显病理改变，而α-雌二醇组小鼠可见肝脏的肝小叶中央区域肝细胞明显肿胀变性、排列紊乱，见图2。

图2　给药14 d典型病理照片（HE染色×200）

表2　给药不同时间血清AST的变化（±s）U/L

表2　给药不同时间血清AST的变化（±s）U/L

组别剂量n给药时间（mg/kg）1 d3 d7 d14 d对照组-10---173.8±42.6溶剂组-10 153.0±46.7166.5±40.6 165.8±44.0 214.2±44.9补骨脂酚组5010 153.5±41.5159.1±50.3 197.7±67.5 191.3±51.4 α-雌二醇组1010---183.3±61.8

表3　给药不同时间血清ALT的变化（±s）U/L

表3　给药不同时间血清ALT的变化（±s）U/L

组别剂量n给药时间（mg/kg）1 d3 d7 d14 d对照组-10---173.8±42.6溶剂组-10 31.2±05.2 50.3±29.1 38.9±14.4 214.2±44.9补骨脂酚组5010 30.5±10.8 34.6±09.6 35.9±05.9 191.3±51.4 α-雌二醇组1010---183.3±61.8

表4　给药不同时间血清ALP的变化（±s）U/L

表4　给药不同时间血清ALP的变化（±s）U/L

注：与溶剂组比较，**P＜0.01，*P＜0.05。

组别剂量n给药时间（mg/kg）1 d3 d7 d14 d对照组-10---123.1±22.4溶剂组-10 168.6±56.1 130.3±31.7158.6±53.1 108.0±38.2补骨脂酚组5010 125.9±36.8 84.0±19.3**111.6±25.7*115.0±33.4 α-雌二醇组1010---252.9±50*

表5　给药不同时间血清TBA的变化（±s）μmol/L

表5　给药不同时间血清TBA的变化（±s）μmol/L

组别剂量n给药时间（mg/kg）1 d3 d7 d14 d对照组-10---26.00±10.98溶剂组-10 21.88±4.70 19.23±9.64 23.64±13.70 30.02±21.00补骨脂酚组5010 19.43±8.78 22.41±9.99 17.27±6.29 22.63±14.20 α-雌二醇组1010---21.90±12.30

3.2补骨脂酚皮下注射不同时间对BSEP和NTCP的影响补骨脂酚50 mg/kg连续皮下注射14 d小鼠，小鼠肝脏中BSEP蛋白表达变化并不明显，给药1、3、7、14 d与溶剂组均无显著差异；而NTCP蛋白表达随着给药时间的延长有升高的趋势，给药14 d时显著高于溶剂组（P＜0.05），见图3。

图3　给药不同时间肝脏BSEP和NTCP蛋白表达

4　讨论

已经有多个研究证实补骨脂酚在体外有十分明显的细胞毒性，对于HepG2、A549、MCF-7、DU-145、THP-1等多个肿瘤细胞增殖有显著抑制作用［15-17］，而在体内却基本没有抗肿瘤研究报道，同时补骨脂酚的体内安全性研究没有报道，这可能是因为补骨脂酚的生物利用度很低的原因［18］。笔者没有观察到补骨脂酚对小鼠有明显的肝毒性表现，有研究认为补骨脂酚可以减轻四氯化碳（CCl4）等造成的肝损害［19］，但其保护机制尚不明了。

50 mg/kg补骨脂酚给药14 d，没有明显影响BSEP，但NTCP却显著升高了。BSEP和NTCP是肝细胞膜上最重要的两个胆汁酸转运蛋白，BSEP将胆汁酸由肝细胞转运至细胞间胆管，NTCP将胆汁酸从血液转运至肝细胞，在非胆道系统出现机械性梗阻的情况下，这两个转运蛋白的变化很大程度上影响着血液和肝细胞内胆汁酸的平衡，单纯的NTCP升高可能致使肝细胞内胆汁酸浓度异常升高。胆汁酸由肝细胞合成分泌，通过各级管道最终分泌到十二指肠，帮助进行脂肪消化，胆汁酸性极强，在细胞内浓度过高可通过线粒体介导导致细胞凋亡，从而导致毒性产生［20］。补骨脂酚影响了小鼠肝脏内胆汁酸转运体的表达，使肝细胞内存在胆汁酸浓度过高的可能，但病理检查并未发现病变，这可能是肝细胞膜上其他转运体也同时发生改变，最终肝细胞内胆汁酸处于一个比较稳定的水平，也可能是因为补骨脂酚作用时间较短，未能体现出明显毒性。

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Influence of Bakuchiol on liver function and bile acid transporters BSEP and NTCP in mouse

BI Ya-nan1，LI Zhen2，ZHOU Kun1，ZHAO Xue-yan1，SHI Hong1，ZHENG Lin1
（1.Institute of Traditional Chinese Medicine，Ministry of Education Key Laboratory of Traditional Chinese Medical Formulae，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To observe the influence of bakuchiol on liver function and bile acid transporters in mice.［Methods］Mice were treated with 50 mg/kg Bakuchiol and 10 mg/kg-estradiol continuously for 14 d.At 1，3，7 and 14 d，mice were divided into several parts to kill.The material from mice killed was for serum biochemical indicators testing.Then mice livers were taken weight and carry on the liver histologic examination and take fresh liver to detect BSEP，NTCP protein expression with ELISA method.［Results］Bakuchiol and α-estradiol had no significant effect on body weight in mice.The subcutaneous injection of α-estradiol for 14 d made mice elevated serum ALP，hepatomegaly，liver coefficient increased，but the Bakuchiol didn't.ALP decreased for the time of the Bakuchiol injection，after 14 d back to normal.Bakuchiol had no effect on the liver BSEP mostly，and would result in higher NTCP gradually，for 14 d NTCP group was significantly higher than the solvent.After 14 d treatment，Bakuchiol groups of mice liver lesions，and α-estradiol group mice liver had cell degeneration.［Conclusion］Bakuchiol treatment for 14 d does not induce liver injury，but hepatotoxicity of α-estradiol is obvious.

Bakuchiol；mice；BSEP；NTCP

R285.5

A

1673-9043（2015）04-02222-04

国家自然科学基金项目（81202991）。

毕亚男（1987-），女，硕士研究生，主要从事中药药理学研究工作。

周昆，E-mail：z.k.ken@263.net。

（2015-03-19）